激動(dòng)性CD40抗體通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡增強(qiáng)抗腫瘤作用的機(jī)制研究

最新研究顯示，全球每年新發(fā)現(xiàn)約1 400萬例腫瘤患者，我國腫瘤的發(fā)生率和死亡率也呈逐年升高趨勢［1］。由于惡性腫瘤進(jìn)展快、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，使得傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)、放療、化療等具有一定的局限性，因此通過誘導(dǎo)機(jī)體的正向免疫促進(jìn)對腫瘤細(xì)胞的免疫清除作用，已成為近年來腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)。激動(dòng)性CD40單鏈抗體（CD40ScFv）保留單克隆抗體具有活性的ScFv片段，去除全抗體的Fc片段，與激動(dòng)性CD40單克隆抗體（CD40mAb）相比，其分子量小，易于到達(dá)病變部位，在機(jī)體代謝中也比較快，不良反應(yīng)較小。本研究旨在觀察激動(dòng)性CD40單鏈抗體（CD40scFv）抑制小鼠腫瘤生長情況及對腫瘤組織中Th1和Th2平衡的改變，探討其通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤作用的機(jī)制，為激動(dòng)性CD40抗體進(jìn)一步在臨床應(yīng)用上提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 Balb/C小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院分子影像實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，帶有CD40scFv基因片段的重組質(zhì)粒由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科研究所惠贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)獲醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)和應(yīng)用委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及儀器 SDS-PAGE凝膠試劑盒（北京Solarbio公司），Ⅳ型膠原酶、Ⅰ型DNA酶（北京So?larbio公司），小鼠CD40單克隆抗體（美國R&D Sys?tems公司），臺式離心機(jī)（美國Thermo Electron Corpo?ration公司），蛋白電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 CD40ScFv誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE檢測 將重組質(zhì)粒pET28a-CD40ScFv轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，帶有重組質(zhì)粒的菌體在IPTG誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后分別離心收集菌體，使用超聲波裂解后將上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE檢測。

1.2.2 CD40ScFv的Western blot與BCA蛋白定量檢測 行SDS-PAGE電泳后取下凝膠，將PVDF膜、濾紙與凝膠于電轉(zhuǎn)儀器上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。TBST洗脫P(yáng)VDF膜，加入抗小鼠單克隆抗體過夜。取出洗脫后加入HRP標(biāo)記抗小鼠IgG，按照ECL方法進(jìn)行顯色曝光。將純化后的CD40ScFv蛋白通過BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量檢測，通過對比樣品的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線，估算樣品中CD40ScFv蛋白的濃度。

1.2.3 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與單細(xì)胞懸液的制備 取出小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞凍存管，迅速轉(zhuǎn)移到37℃恒溫水浴箱中，待其完全融化后離心，向離心管中滴加3 mL完全培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱。取出小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，加入1 mL胰酶-EDTA進(jìn)行消化，將細(xì)胞吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108/mL。

1.2.4 Balb/C小鼠皮下成瘤與激動(dòng)性CD40抗體治療對Balb/C小鼠右腋下皮膚進(jìn)行消毒，于消毒部位刺破皮膚并水平進(jìn)針1 cm，注射單細(xì)胞懸液約200 μL。將單細(xì)胞懸液接種于15只正常小鼠右腋下，每隔3日觀察并記錄腫瘤大小的變化。于接種后第9天開始給予干預(yù)并分為以下3組：1）CD40ScFv組：給予上述從體外制備的CD40ScFv，治療劑量為2 μg/g，治療方式為瘤體注射；2）CD40mAb組：4 μg/g，瘤體注射；3）NS組：給予同體積的生理鹽水。

1.2.5 ELISA法檢測腫瘤組織IL-12的濃度 剝?nèi)∑は履[瘤，剪成1 mm3大小的組織塊，秤取400 mg組織塊放入組織勻漿器，加入PBS溶液3 mL，研磨制成單細(xì)胞懸液，離心并留取上清。將腫瘤組織上清充分混勻，與配置好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到酶標(biāo)孔板中。使用多功能酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品的吸光度值計(jì)算出腫瘤組織中的IL-12濃度。

1.2.6 腫瘤組織浸潤淋巴細(xì)胞的分離 將剪碎的腫瘤組織塊放入離心管中，加入RPMI 1640培養(yǎng)基、Ⅳ型膠原酶、Ⅰ型DNA酶，吹打混勻。將離心管中的懸液過濾并離心，吸取中間云霧層細(xì)胞，該細(xì)胞層即為淋巴細(xì)胞層。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織Th1和Th2 將淋巴細(xì)胞層離心后棄去上清，加入500 μL完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞充分混勻。將細(xì)胞懸液加入到流式管中，各管分別加入FITC標(biāo)記CD4流式抗體。各管離心并棄去上清，使用Fix and Perm重懸細(xì)胞并充分混勻，分別加入APC標(biāo)記的IL-4流式抗體與PE標(biāo)記的IFN-γ流式抗體，上機(jī)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD40ScFv的誘導(dǎo)表達(dá)

在25～35 kD誘導(dǎo)前、后的沉淀中有一個(gè)明顯的條帶，符合預(yù)計(jì)的CD40ScFv蛋白的大?。▓D1）。

2.2 Western blot檢測CD40ScFv蛋白

進(jìn)一步確定純化后所得的產(chǎn)物為CD40ScFv目的蛋白，條帶大小約為27 kD，與預(yù)計(jì)的蛋白大小一致（圖2）。

2.3 BCA檢測CD40ScFv蛋白

CD40ScFv蛋白濃度在562 nm處的吸光度值為0.5083，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的蛋白樣品濃度為1.122 mg/mL。

2.4 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞在顯微鏡下觀察生長狀態(tài)良好，胎盤藍(lán)染色細(xì)胞活力在95%以上（圖3）。

圖1 SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)電泳圖

圖2 Western blot檢測CD40ScFv蛋白表達(dá)

圖3 顯微鏡下小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞（臺盼藍(lán)染色×200）

2.5 激動(dòng)性CD40抗體瘤體注射對腫瘤生長的影響

記錄3組的腫瘤體積變化，繪制出小鼠腫瘤生長曲線（圖4）。CD40ScFv組與CD40mAb組腫瘤大小均顯著小于NS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明激動(dòng)性CD40抗體可以顯著抑制腫瘤的生長。

2.6 ELISA法檢測腫瘤組織中IL-12濃度

CD40ScFv組腫瘤組織中的IL-12濃度為（396.27±48.13）pg/mL，CD40mAb組為（457.63±58.37）pg/mL，均顯著高于NS組（79.51±14.97）pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明激動(dòng)性CD40抗體可以顯著誘導(dǎo)腫瘤組織中的IL-12表達(dá)（表1）。

圖4 小鼠腫瘤生長曲線

表1 CD40ScFv、CD40mAb與生理鹽水對腫瘤組織中IL-12濃度的影響

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腫瘤組織Th1和Th2比值

CD40ScFv組中的Th1/Th2細(xì)胞比值為6.32±0.87，CD40mAb組為5.54±0.71，均顯著高于NS組1.79±0.38，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。表明激動(dòng)性CD40抗體可以改變腫瘤微環(huán)境中Th1/Th2細(xì)胞的失衡，發(fā)揮抗腫瘤的作用（圖5）。

圖5 CD40ScFv、CD40mAb與NS組腫瘤組織中Th1/Th2流式細(xì)胞圖

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD40ScFv、CD40mAb與生理鹽水對腫瘤組織中的Th1/Th2比值影響

3 討論

目前，用于免疫治療的藥物主要是單克隆抗體，其能夠特異性結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原，激活機(jī)體內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用［2］，具有特異性強(qiáng)、均一性好等優(yōu)點(diǎn)。Hodi等［3］報(bào)道，細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4的特異性單克隆抗體ipilimumab已在晚期黑色素瘤Ⅲ期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行，接受治療者與未接受治療者比較具有總體生存優(yōu)勢。一些CD40單克隆抗體雖然已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，并且取得了良好的效果，但因單克隆抗體的分子量大，不能很好透過血管間隙到達(dá)腫瘤組織，而且易引起不良反應(yīng)，表現(xiàn)出一定的局限性［4］。CD40單鏈抗體（CD40ScFv）保留了單克隆抗體具有活性的功能區(qū)域，同時(shí)與單克隆抗體相比，其分子量小，易于到達(dá)病變部位，在機(jī)體代謝中也比較快，不良反應(yīng)較小。本研究將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得需要的CD40ScFv蛋白。IPTG是一種穩(wěn)定的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑，從而使CD40ScFv大量表達(dá)。

樹狀突細(xì)胞（dentritic cell，DC）是目前已知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞活化過程中起著重要的作用。根據(jù)所分泌的細(xì)胞因子的不同，CD4+T淋巴細(xì)胞可分為Th1型和Th2型，Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)，所分泌的細(xì)胞因子具有良好的抗腫瘤作用［5］。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，所分泌的細(xì)胞因子具有抑制腫瘤免疫反應(yīng)的作用。機(jī)體中的Th1與Th2細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡，其平衡的改變與許多疾病有關(guān)，如腫瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等，這種平衡的改變稱為Th1/Th2漂移［6］。Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)向以Th2細(xì)胞占優(yōu)勢狀態(tài)，導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞比值下降，這種改變發(fā)生于大多數(shù)臨床腫瘤患者，包括肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌、基底細(xì)胞癌等［7］。Tosol?ini等［8］報(bào)道結(jié)腸癌患者癌組織中的Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子顯著升高，Murakami等［9］報(bào)道黑色素瘤患者Th2細(xì)胞占優(yōu)勢狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)激動(dòng)性CD40抗體能改變腫瘤組織中Th1/Th2細(xì)胞比值，其具體的機(jī)制尚不清楚。有研究報(bào)道，IL-12是影響Th細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子，腫瘤微環(huán)境中DC等抗原提呈細(xì)胞分泌的IL-12下降可能是影響Th細(xì)胞分化失衡的重要原因［10］。Shao等［11］報(bào)道，TIMP3可以在體外抑制DC活化與成熟，使其下調(diào)分泌IL-12等，進(jìn)而使Th1/Th2比值下降。激動(dòng)性CD40抗體能夠代替CD40配體與DC表面的CD40結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)DC的活化與成熟，上調(diào)IL-12的分泌［12］。

綜上所述，激動(dòng)性CD40抗體通過促進(jìn)DC活化成熟后分泌IL-12，可能是影響腫瘤微環(huán)境中Th1/Th2平衡的重要機(jī)制之一。

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