基于計算機視覺技術(shù)的番茄花青素含量檢測

雷 靜

(成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130)

0 引言

花青素是一種類黃酮類的水溶性色素，廣泛存在于植物體中。植物細胞液為酸性時花青素呈現(xiàn)紅色，為堿性時則呈現(xiàn)藍色?；ㄇ嗨厥侵参锏囊环N次生代謝產(chǎn)物，參與植物自身一些重要的生理功能。研究表明：花青素具有抗氧化、抗增生和抗突變的特性，還能預(yù)防心血管疾病，阻止腫瘤細胞擴散。作為一種天然的色素，花青素的營養(yǎng)保健價值極高，還可以用作食品加工的著色劑[1]。花青素是構(gòu)成花瓣和果實顏色的主要色素之一，許多蔬菜和水果的市場價格都由顏色的深淺決定，反映出花青素巨大的經(jīng)濟價值?；ㄇ嗨氐幕締卧腔ㄉ眨N類有多種，包括飛燕草素、矮牽牛素和錦葵色素，這3類色素覆蓋了花青素90%以上的種類。

番茄可以同時作為蔬菜和水果食用，其果實顏色鮮艷，水分含量大，深受消費者的歡迎。但是，番茄的應(yīng)用價值主要在其所含的番茄紅素，而花青素的含量則相對較少。有研究對番茄的核心種質(zhì)資源庫進行了檢測，僅在極少數(shù)的種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了很低濃度的花青素。與其野生近緣物種如智利番茄、龍葵和葡萄等相似，番茄的花青素都積累在果實的表皮中[2]。即便如此，積累花青素的合成途徑仍存在于番茄中，富含花青素的功能型番茄便成為一個重要的育種目標。除了功能方面的研究外，花青素的生物合成過程和分子機理也在多種植物中得到了闡明，為利用植物基因工程技術(shù)提高花青素含量創(chuàng)造了條件。例如，趙岑等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將花青素調(diào)節(jié)基因VlmybA2轉(zhuǎn)入番茄，使根、莖、葉脈和果實均呈現(xiàn)出紫色，大幅度地提高了番茄花青素的含量[3]。

在花青素的相關(guān)研究中，含量的測定是最基礎(chǔ)的技術(shù)手段。植物不同組織中的花青素含量測定方法有很多種，如正丁醇鹽酸法、香草醛鹽酸法、鹽酸甲醇法和pH示差法等。在實際研究中，一般根據(jù)植物組織不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和特性，選擇相應(yīng)的測定方法。其中，正丁醇鹽酸法和香草醛鹽酸法可以用于測定落葉松樹皮的花青素含量，鹽酸甲醇法則用于測定油菜的種皮[4-5]。這3種方法的原理基本相同，都是將花青素抽提出來成為溶液，然后用分光光度計測量溶液的吸收光譜，計算其中的花青素濃度。pH示差法是根據(jù)花色苷在不同的pH值條件下的形態(tài)不同，顯示的顏色各異來確定花青素的濃度，其測定的穩(wěn)定性和準確性更好[5-6]。隨著實驗技術(shù)的進步，高效液相色譜法也用于花青素的含量測定。該方法操作簡便，可以實現(xiàn)對花青素的精準定量測定，但需要標準濃度的樣品和較昂貴的儀器，限制了它的應(yīng)用范圍[7]。

常規(guī)的方法都需要用植物組織樣品提取溶液，然后通過分析吸光度值或色譜來測定花青素的含量。這些方法對儀器設(shè)備有一定的要求，不能滿足實時、快速和無損傷的要求，測定消耗的物質(zhì)和人力成本也較高；部分方法難以達到很高的精確度，只能進行定性檢測。計算機視覺是一種新興的分析技術(shù)，其概念在20世紀60年代初被提出來，在80年代取得了長足的發(fā)展。計算機視覺的核心內(nèi)容包括圖像的理解和圖像的分析，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到社會發(fā)展的各個領(lǐng)域。計算機視覺在農(nóng)業(yè)上可以用于果實的采摘、分級檢測、田間雜草定位識別和農(nóng)業(yè)機械路徑識別等，代表了現(xiàn)代精準農(nóng)業(yè)的研究和發(fā)展方向。

目前，利用計算機視覺測定作物各種色素含量的技術(shù)方法已經(jīng)成熟，其在葉綠素含量測定中的報道最多[8-11]。這一方法的基本過程是采集目標圖像后提取顏色特征參數(shù)，然后與對應(yīng)的葉綠素含量做相關(guān)性分析，選擇擬合程度最高的特征參數(shù)建立回歸方程并檢驗其準確度。這一方法在辣椒紅色素的含量測定中也有應(yīng)用，但是用于測定植物花青素含量的報道目前還很少[12]。借鑒這些研究，本文利用計算機視覺和統(tǒng)計分析軟件，對番茄成熟果實的各種顏色特征和花青素含量之間的相關(guān)性進行分析，選擇合適的參數(shù)建立計算模型，從而實現(xiàn)對花青素含量的快速無損測定。

1 材料與方法

1.1 番茄果實圖像采集

測定的番茄樣品為從大棚中采集的中雜101品種的成熟果實，個體質(zhì)量在200～300g之間，形狀近圓形，顏色為粉紅色。該品種的果實表皮含有低水平的花青素。

圖像采集系統(tǒng)的硬件包括數(shù)碼相機、暗箱和計算機。計算機軟件為WindowsXP操作系統(tǒng)、MatLab圖像處理工具及SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件。數(shù)碼相機為與計算機連接的Nikon DL24-500型，關(guān)閉閃光燈，安裝在暗箱的頂部，距離番茄果實20cm。暗箱的內(nèi)壁黑色，頂部兩端分別安裝2盞15W的白光燈，底部平臺用于放置被拍攝物體，如圖1所示。選取50個正常的番茄分別編號后進行拍攝，形成JPEG格式的圖片傳入計算機。

1.2 花青素含量的常規(guī)測定

采集完圖像的番茄立即取樣測定花青素含量，具體方法為撕下表皮，稱取約0.1g后剪碎；將表皮碎片放入離心管中，加入5mL的0.1M的HCl，然后在32℃的恒溫箱中靜置5h后過濾。濾液用蘇州島津UV-2450/2550型紫外可見分光光度計讀取530nm波長和1cm光徑下的吸光度值，并用0.1M的HCl作為空白對照；最后，按照文獻介紹的方法計算花青素的濃度[13]。

1.3 圖像預(yù)處理

采集的圖像質(zhì)量受各種因素影響，可能會出現(xiàn)噪音、毛刺和孤立點等問題，不利于對目標區(qū)域的分割和特征提取。因此，需要對圖像進行預(yù)處理，包括灰度化和圖像分割。原始圖片中的番茄是粉紅色，背景主要為黑色，夾雜少量白色的斑點，利用二者之間顏色的差異將番茄從背景中分離出來。彩色圖像的分割首先要進行灰度化，然后根據(jù)顏色進行閾值分割。選擇合適的閾值對于圖像處理分割的效果有著決定性影響，它是通過分析直方圖獲得的。本文中番茄的特征受光照影響不大，因此為了確定閾值，將灰度圖做了最大類間方差分析后再進行圖像二值化；直方圖得到各形狀特征的閾值，然后通過最大閾值分割圖像。圖像的預(yù)處理如圖2所示。

1.4 顏色空間的應(yīng)用

彩色圖像的顏色空間有多種，如RGB、HIS、CMY和YIQ等，本文根據(jù)所采集的圖像特點和研究目的，選擇RGB顏色空間用于模型建立。RGB模型中的R、G和B分別代表圖像中的紅、綠和藍3種顏色的亮度值，通過改變這3者的數(shù)量，可以混合成其它的各種顏色。但是，RGB顏色特征值受到光照強度影響較大。針對這一問題，通常采用變換的r、g、b值來消除光照差異的影響。這3個參數(shù)是以R、G和B為3基色的數(shù)量，對其做歸一化了的數(shù)值。具體的計算公式為：r=R/(R+G+B)，g=G/(R+G+B)，b=B/(R+G+B)，因此r+g+b=1。它們對光照強度的變化不敏感，能夠消除光線差異引起的誤差。另外，還采用了一些上述6個參數(shù)之間的簡單算術(shù)組合作為顏色特征參數(shù)，來與花青素含量之間進行相關(guān)性檢驗。

1.5 模型的構(gòu)建和檢驗

從50個番茄中隨機選取30個樣品的圖片和數(shù)據(jù)作為建模集，用于構(gòu)建模型；剩余的20個樣品的圖片和數(shù)據(jù)作為檢驗集，用于檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_度。在WindowsXP操作環(huán)境中，利用MatLab圖像處理工具提取建模集樣品的圖像特征，分析上述顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的相關(guān)性，選取擬合程度最高的特征參數(shù)建立花青素含量的回歸計算模型。最后，分析檢驗集樣品的圖像，計算花青素含量，對照常規(guī)方法所測的花青素含量值，依據(jù)置信區(qū)間對模型進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 顏色特征參數(shù)與花青素含量間的相關(guān)性分析

利用圖像處理工具和統(tǒng)計分析，對R、G、B及其經(jīng)過形式變換所得的總共18個顏色特征參數(shù)進行了與花青素實際含量之間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)與花青素含量之間存在顯著或極顯著相關(guān)性的參數(shù)分別有6個和7個。其中，R及其作為分母的參數(shù)與花青素含量之間呈正相關(guān)；G及其作為分母的參數(shù)與花青素含量之間呈負相關(guān)，顯著性的程度各異；B及其相關(guān)參數(shù)與花青素含量之間的相關(guān)程度相對較低。R、G、B這3個基本參數(shù)的相關(guān)系數(shù)絕對值在0.304～0.436之間，由其變換得到的部分參數(shù)的相關(guān)系數(shù)絕對值更高，有的接近或超過0.5，表現(xiàn)出更好的擬合性。

顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的相關(guān)性數(shù)據(jù),如表1所示。

2.2 花青素含量測定模型

根據(jù)表1的結(jié)果，選擇R、r、r-g、R-G、R/G和R/(G+B)這6個相關(guān)系數(shù)較大的代表性特征參數(shù)用于建立測定模型，利用統(tǒng)計分析軟件擬合了這些特征參數(shù)與花青素含量之間的回歸方程、決定系數(shù)和均方根誤差，回歸方程的擬合程度通過決定系數(shù)和均方根誤差來評價。結(jié)果表明：以r和R/(G+B)為特征參數(shù)建立的回歸方程的擬合度較好。

表1 顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的相關(guān)性Table 1 The correlation between color characteristic and anthocyanin content

*, **表示檢驗在P<0.05和P<0.01水平上具有顯著性。

顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的回歸模型數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 顏色特征參數(shù)與花青素含量之間的回歸模型Table 2 The regression models between color characteristic and anthocyanin content

*, **表示檢驗在P<0.05和P<0.01水平上具有顯著性。

2.3 模型的檢驗

用表2中的6個回歸方程分別處理檢驗集中的20個樣品的圖像，計算花青素含量，并與實際測定值比較分析，依據(jù)置信區(qū)間檢驗各模型的精確性。正態(tài)分布檢驗結(jié)果表明：6個模型的殘差服從正態(tài)分布，由此計算出顯著水平下的置信區(qū)間。從表3中可以看出：以這6個特征參數(shù)建立的回歸模型都能較好地反映樣品的花青素含量，其中r和R/(G+B)這2個參數(shù)的模型的錯檢個數(shù)少，誤差也更小，說明擬合程度和精確度最高，可以用來預(yù)測樣品中的花青素含量。

回歸模型的精確性檢驗數(shù)據(jù)分析如表3所示。

表3 回歸模型的精確性檢驗Table 3 The accuracy test of regression models

3 結(jié)論

利用計算機視覺技術(shù)對建模集的番茄圖像進行分析，從18個顏色特征參數(shù)中發(fā)現(xiàn)了6個與花青素的實際含量之間存在極顯著的相關(guān)性。分別以這6個參數(shù)為函數(shù)，建立了二者之間的一元二次方程的回歸模型。通過決定系數(shù)和均方根誤差評價，發(fā)現(xiàn)以r和R/(G+B)為特征參數(shù)建立的回歸方程的擬合度最好，對檢驗集花青素含量的預(yù)測表現(xiàn)出很高的精確度，可以作為番茄花青素含量快速無損測定的有效方法。

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