畜禽疫病防控用SPF豬的開發(fā)

高彩霞, 辛 暢, 陳洪巖

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所, 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室, 哈爾濱, 150069)

中國是世界公認的養(yǎng)豬大國，但養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中的疫病問題十分嚴峻，大力開展疫病防控研究是解決問題的出路之一。然而我國對畜禽疫病防控專用實驗動物的研究卻嚴重滯后, 凈化、繁育等標準化技術(shù)體系匱乏, 已成為制約畜禽疫病防控的關(guān)鍵問題[1]。無特定病原體(specific pathogen-free, SPF)豬是國際公認的標準化高等級農(nóng)用實驗動物, 是生命科學(xué)研究、生物制品生產(chǎn)的重要實驗材料和原材料, 而且在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)實踐中發(fā)揮著重要作用[2], 它對于解決在動物疫病發(fā)生、發(fā)展、傳播和致病機制研究以及防疫用生物制品研制中的科學(xué)問題和關(guān)鍵技術(shù), 保證畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展意義重大。

1 SPF豬在畜禽疫病防控研究中的重要性

動物疫病如今不再是一個簡單的疾病問題，已演變成了一個國際政治、經(jīng)濟和社會問題，且日益嚴重，每年不僅給我國的畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，而且一些人獸共患病直接威脅人類的生存和發(fā)展，嚴重影響我國的公共衛(wèi)生和社會安全工作，需要高度重視其防控工作，增強疫病防控的科學(xué)研究，因此針對重大畜禽疫病的防控研究也就對實驗動物提出了特殊需求，需大力開發(fā)畜禽疫病防控用模式動物[3]。SPF豬作為一種很好的模式動物，在畜禽疫病防控研究中發(fā)揮著不可替代的作用，它作為重要的支撐條件已成為生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、畜牧獸醫(yī)科學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)等多領(lǐng)域必需的實驗原料[4]。在畜牧獸醫(yī)科學(xué)中，實驗用豬大量應(yīng)用于重大動物疫病致病機制、免疫機制及防控技術(shù)、疫苗的研制、胚胎移植技術(shù)、飼料營養(yǎng)成分等方面的研究，有效提高畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量及安全性，減少環(huán)境壓力[5]。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如新藥試驗、疾病診斷、疾病研究替代模型、器官移植等也都離不開SPF豬[6]。因此標準化的實驗用SPF豬將對保障我國健康養(yǎng)豬業(yè)與疫病有效防控提供強有力的技術(shù)支撐。

2 國內(nèi)外SPF豬的發(fā)展現(xiàn)狀

2.1 國外SPF豬的發(fā)展現(xiàn)狀

標準化實驗用SPF豬的開發(fā)是農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件之一。目前歐美多數(shù)國家已完成SPF豬的培育，具備成熟的繁育技術(shù)，形成完整的產(chǎn)業(yè)鏈。如美國、加拿大、英國、丹麥、瑞士、德國、法國、荷蘭、原捷克斯洛伐克、南斯拉夫、澳大利亞、日本等國家和地區(qū)先后在政府支持下，建立了SPF豬審定協(xié)會或認定委員會，制定SPF豬認定標準，嚴格控制遺傳學(xué)質(zhì)量，建立了飼養(yǎng)凈化豬群的整套生產(chǎn)體系和管理服務(wù)體系，對疫病的控制多達15種，涵蓋了主要人獸共患病和重要傳染病，具有完整的質(zhì)量標準，全面的檢測技術(shù)，并且建立了嚴格的模型構(gòu)建及評價標準，動物獲取及質(zhì)量有保證。

2.2 國內(nèi)SPF豬的發(fā)展現(xiàn)狀

目前SPF豬已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域, 但我國對于標準化實驗用豬的研究嚴重滯后, 科研、檢定和生產(chǎn)使用實驗用豬多從養(yǎng)殖企業(yè)中篩選, 但其種豬多來自國外, 祖代、曾祖代種豬場中種豬質(zhì)量與國外尚有很大差距, 且由于我國實行強制免疫政策, 故難以獲得畜禽疫病防控研究用實驗豬(如口蹄疫、豬瘟等抗體陰性豬), 也有研究從農(nóng)戶散養(yǎng)豬中篩選, 不僅遺傳背景雜亂, 攜帶的微生物、寄生蟲背景不清，各種疫苗免疫或自然感染形成的抗體水平參差不齊, 導(dǎo)致動物實驗重復(fù)性差, 結(jié)果離散度高[7]。目前大型模式動物小型化是一個發(fā)展趨勢，我國小型豬品種和生產(chǎn)廠家較多，但標準和管理水平不同使得質(zhì)量參差不齊，且主要用于醫(yī)學(xué)研究及食用。嘗試用于疫病感染模型制作，因其有天然疾病抗性，結(jié)果均一性較差。對于SPF豬的研究國內(nèi)少之又少, 僅有北京市SPF豬育種管理中心、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所等單位保有小規(guī)模的SPF豬群。哈爾濱獸醫(yī)研究所于2014年從加拿大引進一批SPF大白豬和長白豬, 開始進行實驗動物化培育, 目前, 豬群已凈化了14種病原，生物學(xué)特性如生殖生理和血液生理生化方面基本穩(wěn)定, 與其他實驗用小型豬差異不大, 且遺傳分化較小, 遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。此外還深入地分析了豬群白細胞抗原(SLA)分子特征和單倍型多樣性, 發(fā)現(xiàn)不同的SLA-1分子體外提呈病原表位抗原肽的能力具有差異, 表明兩種豬群作為實驗動物初步用于疫病研究具有較好的效果, 因此具有較好的研究前景[8-13]。

3 SPF豬開發(fā)存在的問題

3.1 缺乏高質(zhì)量種群，在畜禽疫病防控研究中利用

度較低，推廣力度較差

在豬病、疫苗研究中多使用本動物，但因為我國目前尚無高質(zhì)量的SPF種豬群，僅有個別單位保有小規(guī)模的SPF豬群，在畜禽疫病防控研究和生物制劑研發(fā)、生產(chǎn)等方面推廣利用度較低。大多數(shù)畜禽疫病的研究如疫苗研發(fā)、臨床試驗、藥物篩選、病毒感染主要采用來自農(nóng)村的散養(yǎng)豬，降低了實驗結(jié)果的可靠性，嚴重滯后了畜禽疫病防控的研究進程。

3.2 種群疫病凈化難度較大，遺傳背景雜亂

目前我國規(guī)?；i場發(fā)展迅速，但也存在著相當大的風險。受豬場飼養(yǎng)環(huán)境、管理水平、疫病感染以及國家強制免疫政策等因素的影響，種群疫病難以凈化，尤其是垂直傳播疾病，而且受我國環(huán)境的影響，豬圓環(huán)病毒、豬細小病毒等很難做到徹底凈化。目前如篩選豬圓環(huán)病毒陰性豬群常采用的方法: 大量集中采集豬外周血樣品，同時檢測病原和抗體雙陰性的個體，將其隔離飼養(yǎng)，進而建群; 但是該病呈一過性發(fā)病，不易準確把握發(fā)病時間進行檢測來淘汰陽性個體，不同的時間檢測結(jié)果可能不同，因此很難徹底根除。隨著剖宮產(chǎn)技術(shù)體系的建立，逐漸改用剖宮取胎、無菌接產(chǎn)和屏障或隔離環(huán)境飼養(yǎng)相結(jié)合，達到凈化豬群垂直傳播病原。哈爾濱獸醫(yī)研究所已建立了成熟的剖宮產(chǎn)和無菌接生技術(shù)體系，對產(chǎn)前母豬和接生存活的仔豬進行病原檢測時發(fā)現(xiàn)，母豬豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征、流行性乙型腦炎、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病、豬細小病毒病等為陽性時，接生的存活仔豬全部為陰性，表明無菌接產(chǎn)法起到了較好的凈化效果，有望建立豬圓環(huán)病毒、豬細小病毒等陰性豬群。但是該技術(shù)并不能保證百分百可以剔除垂直傳播病原，且運行成本較高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用胚胎移植技術(shù)培育SPF豬很大程度上彌補了傳統(tǒng)方法的缺陷，而且利用胚胎移植技術(shù)凈化的動物能避免病毒通過胎盤感染仔畜，但仍存在遺傳背景不清晰、來源不清楚等問題，因此缺乏科學(xué)合理的凈化方法和培育技術(shù)也制約了SPF豬種群建立[14]。建立遺傳背景清晰的SPF豬種群，并有效地記錄遺傳信息，將會促進SPF豬實驗動物化進程。

4 畜禽疫病防控用SPF豬種群的培育方法

常用的培育方法: 分析國內(nèi)外畜禽疫病防控研究對SPF豬的使用情況，選取已經(jīng)保有的基礎(chǔ)種群或外引優(yōu)良種群，采用經(jīng)典遺傳學(xué)、常規(guī)繁殖育種學(xué)選育個體，提出微生物、寄生蟲學(xué)質(zhì)量控制標準，通過多指標高密度病原、抗體檢測淘汰陽性個體。對候選動物進行大規(guī)模篩查，加之體表清潔、藥物驅(qū)蟲、滅活疫苗免疫等綜合凈化技術(shù)，結(jié)合剖宮產(chǎn)和無菌接生技術(shù)剔除經(jīng)雌性產(chǎn)道垂直傳播病原等，獲得SPF豬，飼養(yǎng)于屏障/隔離環(huán)境設(shè)施，采用建筑及內(nèi)部正壓方式進行物理隔離，進入設(shè)施的所有飼料、飲水、氣流、物料經(jīng)過滅菌、除菌處理，人員經(jīng)過淋浴、更衣，阻斷所有外界病原體再感染途徑等綜合措施，使獲得的SPF豬得以保存和繁殖?？刂七z傳學(xué)質(zhì)量，同時建立SPF豬病原凈化、培育、繁殖、人工授精、剖宮產(chǎn)、人工飼喂、規(guī)模化生產(chǎn)、品種鑒定等關(guān)鍵技術(shù)，建立生產(chǎn)、飼養(yǎng)標準化技術(shù)體系, 建立核心群。同時定期檢測和維護環(huán)境設(shè)施設(shè)備，采集生物學(xué)特性、表型和基因型大數(shù)據(jù)進行分析，實現(xiàn)共享利用。目前我國SPF豬育種管理中心、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和哈爾濱獸醫(yī)研究所均已建立了成熟的剖宮產(chǎn)和無菌接生技術(shù)體系，可批量提供SPF豬; 重慶市畜牧科學(xué)院具有國內(nèi)唯一的一個無菌豬培育技術(shù)平臺，可以批量提供無菌豬。

此外，還可利用動物克隆技術(shù)、基因修飾和誘變技術(shù)、體細胞和生殖細胞凍存技術(shù)以及特定分子遺傳標記基因(如SLA)篩選技術(shù)，開發(fā)一些特定的畜禽疫病防控研究用SPF豬種群。

5 SPF豬在畜禽疫病防控研究中的應(yīng)用前景

目前, SPF豬在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域研究中得到了廣泛應(yīng)用，是生命科學(xué)取得進步的主要研究平臺之一, 在畜禽疫病防控研究中也有廣泛應(yīng)用前景。

5.1 用于畜禽疫病、人獸共患疫病防控研究

SPF豬對重大疫病的基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究以及生物醫(yī)學(xué)研究有廣泛應(yīng)用前景[15]。如在獸醫(yī)基礎(chǔ)研究方面，實驗用豬大量應(yīng)用于動物重大疫病致病機制、免疫機制及防控技術(shù)研究，如豬瘟、高致病性藍耳病、口蹄疫等重大疫病病原學(xué)、病原遺傳變異與分子進化、診斷與監(jiān)測技術(shù)以及新型疫苗研制等。哈爾濱獸醫(yī)研究所保存的SPF大白豬和長白豬, 已凈化了14種病原, 且遺傳分化較小, 遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可利用其優(yōu)勢研究影響培育的重要傳染病病原的宿主關(guān)鍵分子，為改造特定SPF豬資源的培育提供修飾靶點，進而運用基因修飾技術(shù)建立抗病性較強的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炗秘i新品種。開發(fā)標準化實驗用豬將對保障我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展與疫病有效防控提供強有力的技術(shù)支撐，也可加快多種嚴重危害畜牧業(yè)的烈性病研究, 從而加強相關(guān)的疫病防控工作。

5.2 用于生物制品研發(fā)、生產(chǎn)和檢驗研究

獸醫(yī)科學(xué)在動物疾病、人獸共患病研究中的作用是不言而喻的，生物制品在動物疫病防控過程中也是起著關(guān)鍵作用。開發(fā)畜禽疫病防控專用SPF豬既能提高傳統(tǒng)疫苗產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，研制新型高效疫苗控制疫情, 發(fā)展獸用疫苗產(chǎn)業(yè)，加快產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新, 也可滿足獸醫(yī)生物制品和人用疫苗研發(fā)、生產(chǎn)與檢驗中對大量標準化實驗用豬的需求[16]。同時可用作高品質(zhì)生物制品原料獲取的主要來源，如提供合格的高品質(zhì)SPF豬陰性血清，促進豬病相關(guān)的基礎(chǔ)研究、檢測方法的建立, 也是動物源性生物醫(yī)用材料的主要來源，如角膜、包膜、膠原膜等。

5.3 用作人類醫(yī)學(xué)研究的主要模型

在人類醫(yī)學(xué)模型創(chuàng)制過程中，選擇哪種實驗動物作為靶動物是一個需要認真考慮的問題。從進化角度選擇，非人靈長類動物與人的相似性可能更高，但是從實驗動物的倫理和資源的獲得上，使用非人靈長類動物會受到各種的限制[17]。豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機制等方面與人相似，目前已被廣泛運用于心血管病、糖尿病、皮膚燒傷、血液病等多方面研究，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價值，同時也在人用疫苗的研發(fā)和評價中發(fā)揮著不可替代的作用[18]。哈爾濱獸醫(yī)研究所保存的SPF大白豬和長白豬，生物學(xué)特性如生殖生理和血液生理生化方面基本穩(wěn)定，部分血液生理生化指標與人相似，可以作為人類醫(yī)學(xué)研究的替代模型，如利用SPF豬遺傳背景清晰且遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的優(yōu)勢研究如先天性紅眼病、卟啉病、先天性小眼病、先天性淋巴水腫等遺傳性疾病，可以提高研究結(jié)果的準確性和可靠性; 也可以用于構(gòu)建心血管疾病的實驗用動物模型，對研究心血管疾病形成的因素及治療藥物的開發(fā)具有較高價值。

5.4 用作異種器官移植的供體

由于豬在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)等方面與人類具有較大的相似性，其心臟、肝臟、腎臟、胰島以及神經(jīng)細胞和軟骨細胞，在結(jié)構(gòu)和功能上與人幾乎完全一致，可發(fā)揮原有器官的作用，因此是人類異種器官移植的重要來源[19]。將豬基因人源化改造后，能夠批量生產(chǎn)出人類需要的細胞、組織、血液以及器官, 為人類開展異種器官移植和生物材料提供了充足的供體材料，是未來人類生命研究的一個重點發(fā)展方向，將為攻克人類重大疾病開辟道路。也有研究[20]利用巴馬小型豬，建立了人肝癌異種移植模型，探索人肝癌細胞能否在豬的肝臟中存活，在腫瘤治療和異種移植動物模型的建立研究中發(fā)揮著十分重要的作用。成年豬體大約攜帶有120多種病毒，任何一種影響人類的病毒隨移植侵入, 都將導(dǎo)致不可預(yù)見的風險[21]。不僅異種移植受體本人有感染已知或未知病毒的風險，而且與受體密切接觸者也有被感染的風險，因此“五星級”無指定病原體(DPF)豬的開發(fā)更為重要。此外，異種移植時，由于供體豬種屬差異，受體對豬的器官會發(fā)生強烈的免疫排斥反應(yīng)，主要包括超急性免疫排斥、急性血管性免疫排斥和急性細胞性免疫排斥。SLA是引起豬-人異種器官移植急性細胞性排斥的遺傳因素之一。以不同SLA單倍型豬為供體進行異種器官移植后，移植效果存在明顯差異。異種移植引起的CD8+T和CD4+T細胞免疫排斥反應(yīng)的大小主要取決于供體細胞表面SLA I、II類分子與被CD8、CD4分子識別的HLA分子的同源性。豬-人異種移植時，供體SLA與受體HLA分子不可能完全匹配, 只能選擇相似度較高的供受體組合進行器官移植，即移植前需進行嚴格的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)配型，有利于減少免疫學(xué)因素的影響，延長受體和移植物的存活時間。因此, 明確不同豬品種的SLA單倍型特征對豬-人異種器官移植MHC配型的研究具有重要意義。目前已對哈爾濱獸醫(yī)研究所保存的SPF大白豬和長白豬進行了SLA單倍型特征分析，發(fā)現(xiàn)了62個SLA等位基因，分別組成了17個I類和11個II類單倍型, 具有高度的多樣性和潛在的器官移植價值[10,22]。此外還對我國多個地方品種進行了SLA單倍型多樣性的研究，如: 巴馬小型豬、五指山小型豬、融水小型豬和貴州小型豬等[22-26]。

標準化SPF豬群是生命科學(xué)研究的重要支撐條件之一, 更是畜禽疫病防控技術(shù)研發(fā)的核心支持。然而我國在該方面的研究卻嚴重滯后, 制約了動物疫病防控產(chǎn)品的創(chuàng)制、防控措施的建立和防控效果的科學(xué)評價[27]。面向國家科技創(chuàng)新發(fā)展新態(tài)勢和畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展重大問題研究對實驗動物資源的需求, 開發(fā)畜禽疫病防控用SPF豬已成為當前必須面對和加以解決的關(guān)鍵問題。我國在2017年國家重點研發(fā)計劃重點專項“畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖技術(shù)研發(fā)”中設(shè)立了“畜禽疫病防控專用實驗動物開發(fā)”項目, 表明我國已經(jīng)將SPF豬的培育列入了重點研究范疇。