甜味蛋白特性及其表達(dá)的研究進(jìn)展

何明娟，鄒曙明，蔣霞云，劉寧

（上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306）

甜味是深受人們喜愛的一種味覺，到目前為止，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并使用的甜味劑大概有20種，可分為糖醇類甜味劑、非糖甜味劑、人工合成的非營(yíng)養(yǎng)甜味劑三類。1968年，人們首次從植物果實(shí)中分離得到一種能將酸味變?yōu)樘鹞兜牡鞍踪|(zhì)—Miraculin，從而開始了對(duì)天然甜味蛋白的研究和應(yīng)用，但大自然植物中提取到的甜味劑種類較少，且工藝?yán)щy，使用率較低。

1 甜味蛋白的種類

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的植物甜味蛋白有8種，即Brazzein、Thaumatin、Monelin、Curculin、Mabinlin、Miraculin、Pentadin和新近發(fā)現(xiàn)的Neoculin。其中，Brazzein、Thaumatin、Monellin、Mabinlin、Pentadin這5種為甜味蛋白，它們本身就具有甜味；Miraculin和Neoculin為甜味誘導(dǎo)蛋白，具有甜味調(diào)節(jié)功能，可以使酸味等其他味感變?yōu)樘鹞?；Curculin兼有前兩類蛋白質(zhì)的甜味特性。

1.1 Thaumatin

Thaumatin，又稱索馬甜、沙馬汀，是從非洲竹芋科植物Thaumatococcus daniellii的果實(shí)中分離出的一類強(qiáng)烈甜味的蛋白質(zhì)，為淡黃褐色至灰褐色粉末，無(wú)臭味，味極甜。Thaumatin甜味閾值為1.1 mg/kg，在高于甜味閾值濃度時(shí)，甜度為蔗糖的5 500～8 000倍[1]。Thaumatin均由一條多肽鏈組成，分子量約為22 kD，等電點(diǎn)在11.5～12.5，屬于堿性蛋白，加熱可發(fā)生變性而失去甜味，Thaumatin在酸性條件下熱穩(wěn)定性好，在堿性或中性條件下熱穩(wěn)定性相對(duì)較差。

1.2 Monellin

Monellin，中文被稱為莫奈林，是從西非的一種植物Dioscoreophy Ilum cummitasii中分離得到的。Monellin分子由A、B兩條鏈共94個(gè)氨基酸殘基組成，A、B兩條鏈通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合在一起。影響Monellin蛋白穩(wěn)定性的因素有共價(jià)鍵作用力和非共價(jià)鍵作用力，蛋白表面的電荷和氨基酸殘基會(huì)對(duì)它的甜味產(chǎn)生影響，尤其是Ca2+，這可能與味細(xì)胞中的Ca2+介導(dǎo)的陽(yáng)離子通道有關(guān)。Monellin蛋白活性受溫度和pH的影響，50 ℃以上、pH較低的條件下，蛋白失活，甜味降低[2]。

1.3 Mabinlin

Mabinlin，即馬檳榔甜蛋白，是從中國(guó)云南等省的高海拔地區(qū)白花菜科植物Cappari Smasaikai Levi的種子中分離提純到的一種甜蛋白。Mabinlin蛋白有4種同系物，分別為MabinlinⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，MabinlinⅡ相關(guān)的研究最多。MabinlinⅡ由A、B兩條鏈組成，A鏈含有33個(gè)氨基酸殘基，B鏈含有72個(gè)氨基酸殘基。MabinlinⅡ熱穩(wěn)定性最好，甜度約是等質(zhì)量蔗糖的400倍，其甜味在80 ℃至少可保持48 h不被破壞，而其他3種在80 ℃下保持0.5 h甜味就喪失[3]。

1.4 Brazzein

Brazzein，中文被譯為布拉珍，是從非洲西部野生植物Pentadiplandra Brazzeana的果實(shí)中分離提純得到的。Brazzein是由54個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多態(tài)，相對(duì)分子質(zhì)量為6.5 kDa，等電點(diǎn)為5，甜度約是等質(zhì)量蔗糖的2000倍。Brazzein是一種單鏈蛋白，是在植物甜味蛋白家族相對(duì)分子量最小的。Brazzein甜味蛋白水溶解性、熱力學(xué)穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性都較好，Brazzein分子在85 ℃時(shí)仍保持折疊形式，即使在80℃下熱處理4 h依然保持甜味活性，在高pH值溶液中也仍保持甜味活性[4]。

1.5 Pentadin

Pentadin，被譯為培它丁，是1989年從非洲熱帶植物Pentadiplandra Brazzeana的果實(shí)中分離提取出的。其分子量為12 kDa，甜度為蔗糖的500倍，整個(gè)分子是以亞結(jié)構(gòu)通過(guò)二硫鍵相連的。Pentadin和Brazzein來(lái)自同一種植物，Pentadin是果實(shí)經(jīng)熱干燥后提取得到的，Brazzein是從鮮果中提取得到的。Pentadin是非天然形態(tài)的交聯(lián)Brazzein分子，分子量約為Brazzein的2倍，且甜度明顯低于Brazzein[5]。

1.6 Curculin

Curculin，又稱仙茅蛋白、庫(kù)克靈，是從馬來(lái)西亞石蒜科光葉仙茅植物Curculingo Latifolia的果實(shí)中分離得到的。它是一種不含糖基的單純蛋白，有含114個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)為7.1，對(duì)熱敏感，50 ℃以上活性降低，其甜度約為等質(zhì)量蔗糖的2 000倍。它的甜味消失后，可用檸檬酸或維生素C誘導(dǎo)恢復(fù)并產(chǎn)生強(qiáng)烈的甜味，其本身具有甜味又能使檸檬酸等有機(jī)酸變甜。

1.7 Miraculin和Neoculin

Miraculin，中文被譯為奇異果素、奇果蛋白等。是從西非植物Richadelladulcifa Baehni的紅色漿果中提取得到。Miraculin相對(duì)分子量約為24.6 kDa，是由191個(gè)氨基酸和N連接寡糖組成的單一多肽鏈，等電點(diǎn)約為9。Miraculin蛋白在100 ℃以下、pH 3～12范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，其本身并無(wú)甜味，遇到酸性物質(zhì)后可以改變?nèi)说奈队X，因此稱其為矯味蛋白。

Neoculin是一種與Curculin同源且具有味道修飾作用的甜味蛋白，甜度約是等質(zhì)量蔗糖的500倍。Neoculin是一種由一個(gè)N端糖基化酸性亞基NAS和一個(gè)基本單位NBS組成的異二聚體糖蛋白，Neoculin一維和三維結(jié)構(gòu)均類似于單子葉植物中的甘露糖凝集素[6]。

2 甜味蛋白表達(dá)研究進(jìn)展

2.1 Thaumatin的表達(dá)研究進(jìn)展

研究人員在不斷地進(jìn)行Thaumatin的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，曾將Thaumatin基因轉(zhuǎn)入不同的宿主，但都沒有獲得大量重組的具有活性的Thaumatin。2004年，孔建強(qiáng)等[7]利用基因工程技術(shù)，將分別克隆在兩個(gè)不同載體上的甜味蛋白基因連接成一個(gè)完整的cDNA基因，并將該基因克隆進(jìn)載體pBI121，通過(guò)凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌，再轉(zhuǎn)入煙草植株，雖然在成熟煙草植株中檢測(cè)到甜味蛋白目的基因，但并沒有在轉(zhuǎn)基因煙草中檢測(cè)到表達(dá)的甜味蛋白。2007年，研究人員將基因?qū)氲酱篼溨?，大大提高了產(chǎn)量，平均每千克大麥可以產(chǎn) 2 g蛋白[8]。

2.2 Monellin的表達(dá)研究進(jìn)展

Monellin蛋白已實(shí)現(xiàn)了在原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。將Monellin在畢赤酵母中表達(dá)，并利用響應(yīng)面優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，但表達(dá)量較低，或存在產(chǎn)物活性偏低的現(xiàn)象。為了實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，學(xué)者多將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性Monellin基因進(jìn)行優(yōu)化，獲得了令人滿意的結(jié)果。通過(guò)在Monellin蛋白中不同位點(diǎn)的氨基酸的丙氨酸取代獲得突變體，并評(píng)估其熱穩(wěn)定性和甜味閾值的變化，其結(jié)果表明，通過(guò)基因突變技術(shù)可以改善天然Monellin蛋白的熱穩(wěn)定性和甜味，可以實(shí)現(xiàn)Monellin的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 Mabinlin的表達(dá)研究進(jìn)展

至今，對(duì)Mabinlin Ⅱ基因研究主要是在各種植物、原核生物中表達(dá)。研究人員已經(jīng)成功地在根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下將Mabinlin Ⅱ基因?qū)肴n苣、西瓜、番茄中，通過(guò)分析，確定已將Mabinlin Ⅱ蛋白基因成功整合到重組植物的基因組中。2009年顧文亮等[9]對(duì)Mabinlin Ⅱ基因進(jìn)行剪切重組，再克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a(+)，將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，在IPTG誘導(dǎo)下，重組Mabinlin Ⅱ基因首次在大腸桿菌中表達(dá)。2011年王昌博等[10]將兩種形式的重組Mabinlin Ⅱ?qū)氪竽c桿菌中表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)后成功表達(dá)，雙盲測(cè)試可檢測(cè)到輕微甜味和后甜感。

2.4 Brazzein的表達(dá)研究進(jìn)展

Brazzein在原核生物中的表達(dá)主要集中在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌，尤其是在以大腸桿菌作為表達(dá)菌的研究中，目的蛋白的產(chǎn)量及生物活性都有了很大提高。王長(zhǎng)遠(yuǎn)等[4]為了提高甜味蛋白Brazzein的產(chǎn)量及甜度，將第29位的天冬氨酸、第31位的組氨酸和第41位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷⒈彼?、賴氨酸，?duì)編碼區(qū)進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表面表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)果驗(yàn)證甜味蛋白Brazzein成功表達(dá)于乳酸乳球菌表面。趙紅玲等[10]將含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115中，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，其相對(duì)分子量與理論值一致，并得到有微甜味的表達(dá)產(chǎn)物。

2.5 Curculin、Miraculin和Neoculin的表達(dá)研究進(jìn)展

現(xiàn)今關(guān)于Curculin的加工制備研究相對(duì)較少，對(duì)比于其他甜蛋白基因工程技術(shù)在仙茅蛋白表達(dá)中的應(yīng)用相對(duì)滯后。研究表明，Miraculin的合成基因可以在在大腸桿菌中表達(dá)，也可在番茄中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。目前尚未有成功表達(dá)Curculin的報(bào)道，但Neoculin已被成功表達(dá)，Nakajima等[6]利用帶有KEX2剪切位點(diǎn)的α-淀粉酶分別與兩個(gè)蛋白亞基融合，成功獲得與天然Neoculin具有同樣活性的重組Neoculin。

3 甜味蛋白鑒定方法和甜度測(cè)定方法

3.1 甜味蛋白的鑒定

常用的甜味蛋白鑒定分析方法有SDS-PAGE、免疫印跡及蛋白的質(zhì)譜檢測(cè)三種。將得到的甜味蛋白進(jìn)行SDS-PAGE定性分析，探究重組基因是否在宿主內(nèi)表達(dá)了目的甜味蛋白、甜味蛋白的分子量大小是否與預(yù)估值相符、也能做簡(jiǎn)單的定量分析。將SDSPAGE上的純化后的蛋白使用免疫印跡分析鑒定基因是否表達(dá)。將SDS-PAGE上的純化后的蛋白使用MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)一步分析鑒定，確定蛋白的氨基酸序列。

3.2 甜味蛋白的甜度測(cè)定

甜味蛋白是一種新型的甜味劑，甜度測(cè)試方法一般采用雙盲檢測(cè)法。將100 mL發(fā)酵液在4 ℃條件下，以5 000 r/min冷凍離心5 min，收集的細(xì)胞加10 mL無(wú)菌去離子水重新懸浮。冰浴中100 W超聲波破碎15 min，超聲3 s，停止3 s。菌液在4℃以12000 r/min冷凍高速離心20 min，收集上清液。用0.25 μm孔徑濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾，取少量濾液進(jìn)行活性測(cè)試，同時(shí)針對(duì)陰性對(duì)照和目的甜味蛋白的上清液，采取多人員進(jìn)行雙盲測(cè)試，感官評(píng)定比較其甜度。

4 挑戰(zhàn)與前景

傳統(tǒng)的天然植物蛋白的產(chǎn)量不高，研究人員為獲得安全高產(chǎn)量的甜蛋白利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆其編碼區(qū)，運(yùn)用基因工程技術(shù)，根據(jù)氨基酸序列人工合成甜味蛋白基因，然后將甜味蛋白基因轉(zhuǎn)入微生物或高等植物中進(jìn)行外源表達(dá)。在這些研究進(jìn)行的過(guò)程中，想要應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)甜味蛋白，重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性、基因工程菌的穩(wěn)定性、目的基因在宿主中能否表達(dá)，基因表達(dá)的誘導(dǎo)條件、所表達(dá)的蛋白的甜味活性以及尋找甜味的科學(xué)檢測(cè)方法，都是需要面對(duì)和克服的困難。雖然微生物發(fā)酵生產(chǎn)甜味蛋白仍處于實(shí)驗(yàn)階段，但隨著酵母、大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)研究的不斷深入，利用基因工程菌生產(chǎn)甜味蛋白具有極其誘人的前景。