大孔樹脂-結(jié)晶法精制蔓三七葉黃酮的集成技術(shù)研究

涂招秀，謝欣＊，胡居吾，黃斌華

（1.江西省科學(xué)院，江西南昌 330096；2.江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西贛州 330000）

蔓三七，又名平臥菊三七、蛇接骨、續(xù)命草、神仙草，味辛、微苦、性涼，為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營養(yǎng)豐富，富含粗多糖和綠原酸，同時還含有總黃酮、維生素A、維生素C、氨基酸，富含有機鈣等成分。民間利用其通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛、消炎止咳，治療跌打損傷、支氣管肺炎、肺結(jié)核等[1]?，F(xiàn)代生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證明，蔓三七具有通經(jīng)活絡(luò)、消炎止咳、散淤消腫、活血生肌等功效[2]；能延緩衰老、激活免疫細胞、改善機體免疫功能、提高人體免疫力，增強人體的新陳代謝并對記憶障礙有一定改善作用[3]；具有降血壓、降血糖和預(yù)防慢性腎病、抑制乙型肝炎的顯著效果[4]；對預(yù)防和治療心腦血管疾病、糖尿病等有一定的療效[5]；還具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志賀樣毒素細胞的活性[6]。

大孔吸附樹脂是近幾十年發(fā)展起來的一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)、人工合成的有機高分子新型分離材料[7]，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于有機溶劑及酸堿，不受低分子化合物、無機鹽類及強離子的干擾，吸附成效好，容易再生，使用周期長，被廣泛用于分離純化天然產(chǎn)物[8]。近年來，我國在使用大孔樹脂對天然產(chǎn)物的分離、純化工作已十分普遍[9-10]。

本試驗以蔓三七葉為原料采用大孔吸附樹脂-結(jié)晶法相結(jié)合的集成技術(shù)，從蔓三七葉中分離純化得到含量高的蔓三七葉黃酮，為開發(fā)以蔓三七葉黃酮為主的藥品及功能性食品提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓三七葉，江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，烘干、粉碎后過20目篩備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

大孔樹脂D101、AB-8、S-8、NKA-9購于南開大學(xué)化工廠，HPD-100、HPD-300購于滄州寶恩化工有限公司，306型購于揚州制藥有限公司；95%乙醇、乙酸乙酯、均為分析純；吸附柱：60×800 mm，自制。

751型紫外分光光度計（上海第二分析儀器廠）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（北京醫(yī)用離心機廠）；YZG-600真空干燥箱（瑞安金安制藥機械有限公司）；AE163電子天平（余姚紀(jì)銘設(shè)備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

蔓三七葉→干燥→粉碎→過篩（20目）→動態(tài)超高壓微射流均質(zhì)輔助提取→過濾→濾液→上柱吸附→洗脫→減壓回收乙醇→進一步濃縮→重結(jié)晶→真空干燥→蔓三七葉黃酮產(chǎn)品。

1.2.2 測定方法

精確稱取在120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品0.200 0 g，置于100 mL容量瓶中，加80%乙醇70 mL，置于水浴上微熱使溶解，冷卻至室溫，加乙醇至刻度，搖勻。精密吸取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液。精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL和7.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加乙醇6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，后加5%氫氧化鈉試液10.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以乙醇為參比，用1 cm比色皿，于紫外可見分光光度計上，在400～600 nm波長處進行掃描。結(jié)果表明，對照品溶液在510 nm處有最大吸收，因此選擇510 nm作為測定波長。在510 nm波長處測定體系的吸收度，以吸收度（A）為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樹脂靜態(tài)吸附實驗[11]

1.2.3.1 樹脂的預(yù)處理

用乙醇反復(fù)浸泡洗滌，直至乙醇洗出液透明無色，再依次用體積分?jǐn)?shù)2%的鹽酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的氫氧化鈉進行洗滌，最后用蒸餾水洗至中性。

1.2.3.2 靜態(tài)吸附-解吸實驗

稱取1 g處理好的樹脂置于250 mL的錐形瓶中，再量取同體積、同濃度的蔓三七葉黃酮提取液，加入裝有樹脂的錐形瓶中，恒溫振蕩24 h達吸附平衡，測吸附前后蔓三七葉黃酮溶液在510 nm處的吸光度值，并計算靜態(tài)吸附率。將吸附實驗過濾后的樹脂置于250 mL的錐形瓶中，加入20 mL 70%乙醇作為洗脫劑，用玻璃紙封口后，置于搖床振蕩（110 r/min；30 ℃）解吸，4 h后取出，抽濾，測定濾液中在510 nm處的吸光度值。吸附量(Q)公式如下：

其中，C0：原液中蔓三七葉黃酮濃度，mg/mL；C1：流出液中蔓三七葉黃酮濃度，mg/mL；V：吸附液體積，mL；W：干樹脂重量，g。

解吸量(Q)公式如下：

式中，Q’：解吸率；C0：原液中蔓三七葉黃酮濃度，mg/mL；C1：流出液中蔓三七葉黃酮濃度，mg/mL；V1：為洗脫液體積，mL；V：吸附液體積，mL。

1.2.3.3 樹脂動態(tài)吸附實驗

以最佳樹脂為吸附樹脂，在室溫下采用濕法將預(yù)處理好的樹脂裝入吸附柱中（樹脂高30 cm，柱內(nèi)徑為3 cm），分別采用不同的流速將蔓三七葉黃酮提取液上柱吸附，分時間段收集流出液，直到流出液在440 nm處的吸光度值為粗提液的5%時，停止吸附，以選擇適宜的吸附流速。

1.2.3.4 動態(tài)洗脫實驗

先用2倍樹脂體積的水或低濃度（10%左右）乙醇水溶液洗滌吸附了蔓三七葉黃酮的樹脂，再分別用5倍樹脂體積的不同濃度的乙醇水溶液對吸附飽和的吸附柱進行洗脫，測定洗脫液在510 nm處的吸光度值，確定適宜的洗脫溶劑濃度。

1.2.3.5 結(jié)晶實驗

對洗脫液在真空條件進行回收乙醇和濃縮，再對其進行真空冷冰干燥，得蔓三七葉黃酮較純產(chǎn)品，采用分光光度計法對其進行含量測定。取一定量的產(chǎn)品，用適量70 ℃溫水進行溶解，后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱中進行重結(jié)晶，靜置12 h后，抽濾，濾餅，再按上述方法重結(jié)晶幾次，最后的濾餅在真空下干燥，得蔓三七葉黃酮精品，采用分光光度計法對其進行含量測定。

2 結(jié)果和分析

2.1 蔓三七葉黃酮的最佳提取條件

以蔓三七葉為原料，研究動態(tài)超高壓微射流技術(shù)對蔓三七葉中黃酮得率的影響。以單因素實驗為基礎(chǔ)，選取乙醇濃度、提取溫度、提取時間、動態(tài)超高壓微射流均質(zhì)壓力為主要因素進行研究，通過正交實驗法優(yōu)化蔓三七葉中黃酮的提取工藝。經(jīng)正交實驗法優(yōu)化后蔓三七葉中黃酮提取的工藝條件為乙醇濃度80%、提取溫度65 ℃、提取時間2.0 h、微射流均質(zhì)壓力80 MPa、微射流均質(zhì)次數(shù)2次、液料比15 mg/mL、提取次數(shù)2次。此時，蔓三七葉黃酮的得率為1.95%。

本實驗借助的動態(tài)超高壓微射流技術(shù)是一種新興的超微細化技術(shù)，它能對物料產(chǎn)生強烈剪切作用、高頻振蕩、高速撞擊和壓力瞬間釋放等一系列的綜合作用，從而導(dǎo)致物料的細胞或細胞壁破碎，從而使物料的活性成分溶出，與常規(guī)法相比較，具有提取時間短、蔓三七葉黃酮提取率高等優(yōu)點，可以大大提高生產(chǎn)效率，而且不會影響物料中的活性成分。

2.2 各種樹脂靜態(tài)吸附性能的比較

采用上述提取液（濃度25.6 mg/mL）做各種樹脂靜態(tài)吸附性能的比較實驗，結(jié)果見表1。對蔓三七葉黃酮靜態(tài)吸附量較大的樹脂為306型。

表1 各種樹脂對蔓三七葉黃酮的吸附量、解吸率以及吸附的選擇性

2.3 不同流速對吸附效果的影響

吸附流速影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴散，從而決定吸附效果，如果流速太快，溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂內(nèi)表面，就會發(fā)生漏過，造成樣品流失。

采用提取液各300 mL以不同的流速通過吸附柱（樹脂高30 cm，柱內(nèi)徑為3 cm），測流出液的吸光度值，如圖1所示，吸附流速分別為1、2、3、4 mL/min和5 mL/min時，泄漏率對應(yīng)為5.16%、6.57%、13.14%、20.47%和23.16%。此結(jié)果顯示，吸附流速越大，蔓三七葉黃酮的泄漏越嚴(yán)重，但流速過慢則會延長生產(chǎn)周期，節(jié)約生產(chǎn)成本，從數(shù)據(jù)可知，當(dāng)流速在1 mL/min和2 mL/min時，兩者之間的泄漏率相差不大，從生產(chǎn)周期和生產(chǎn)成本上考慮，宜選擇吸附流速2 mL/min為適。

圖1 不同流速對泄漏率的影響

2.4 不同濃度洗脫劑對洗脫效果的影響

圖2為不同濃度洗脫劑對回收率的影響，當(dāng)乙醇濃度分別為30%、50%、70%、80%和90%時，蔓三七葉黃酮的回收率分別為52.35%、66.65%、90.86%、91.07%和91.91%，可見洗脫劑的濃度越高，回收率越高，但當(dāng)洗脫劑濃度超過70 %以后，蔓三七葉黃酮已基本洗脫完全，再增大濃度對回收率影響不大，綜合考慮成本等因素，選用70%的乙醇作為洗脫劑為宜。

圖2 不同乙醇濃度洗脫劑對回收率的影響

2.5 洗脫液的濃縮及干燥

洗脫液在60 ℃、0.085 MPa的真空下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行回收洗脫劑并進行濃縮，濃縮液然后真空下干燥，得蔓三七葉黃酮產(chǎn)品。實驗結(jié)果表明，選定306型大孔樹脂為蔓三七葉黃酮的吸附樹脂，吸附流速2 mL/min；吸附完畢后用70%的乙醇洗脫，洗脫率在90.86%以上，在此條件下得到蔓三七葉黃酮較純產(chǎn)品，含量為66.6%。

2.6 重結(jié)晶次數(shù)對產(chǎn)品得率與純度的影響

重結(jié)晶技術(shù)對蔓三七葉黃酮產(chǎn)品的得率與純度變化曲線結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 重結(jié)晶次數(shù)與產(chǎn)品得率的關(guān)系

圖4 重結(jié)晶次數(shù)對產(chǎn)品純度的關(guān)系

由圖3可知，蔓三七葉黃酮產(chǎn)品得率隨重結(jié)晶次數(shù)的增加而減少，尤其是第一次結(jié)晶得率為89.5%，到第4次時產(chǎn)率降低到55.9%。圖4表明，蔓三七葉黃酮純度隨重結(jié)晶次數(shù)的增加提高較快，提取物純度由66.6%提高到第4次的91.8%，尤其是經(jīng)過前3次重結(jié)晶后其純度提高顯著。

3 結(jié)論

采用大孔吸附樹脂-結(jié)晶法相結(jié)合的集成技術(shù)，對蔓三七葉中分離純化得到含量高的蔓三七葉黃酮。選定306型大孔樹脂為蔓三七葉黃酮的吸附樹脂，吸附流速2 mL/min；吸附完畢后用70%的乙醇洗脫，洗脫率在90.86%以上，在此條件下得到蔓三七葉黃酮較純產(chǎn)品，含量為66.6%。上述較純產(chǎn)品再采用多次重結(jié)晶技術(shù)對其進一步純化，蔓三七葉黃酮產(chǎn)品得率隨重結(jié)晶次數(shù)的增加而減少，但其含量隨重結(jié)晶次數(shù)的增加而增加，第4次重結(jié)晶后，蔓三七葉黃酮產(chǎn)品含量為91.8%。