小麥細(xì)胞色素P450基因克隆及其序列研究

高璇

（山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟(jì)南250000）

細(xì)胞色素P450廣泛地分布在動(dòng)物、植物和微生物中。P450在高等植物的微粒體、液泡膜、線粒體膜等中大量存在，其中在微粒體中的含量最高。植物的各器官中，葉片中含有的細(xì)胞色素P450最高，其次是花朵、莖中。植物細(xì)胞色素P450對(duì)植物本身有著非常多作用，有助于植物新陳代謝，合成或分解激素，還能抵御生物以及非生物脅迫，用于合成花粉孢粉素等。

1 細(xì)胞色素P450的發(fā)現(xiàn)

1969年，D.S.Frear等人首次在棉花中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素P450，隨后在更多的植物中發(fā)現(xiàn)了P450，如小麥、水稻中[1]。根據(jù)現(xiàn)階段的研究成果，P450的基因數(shù)目占據(jù)了物種總基因數(shù)目的1%，說(shuō)明了細(xì)胞色素P450基因的多樣化。小麥作為我國(guó)主要的糧食作物之一，在生長(zhǎng)過(guò)程中，P450基因發(fā)揮著重要的作用，能提升小麥的抗逆性，豐富其抗性基因資源。參照以往的小麥細(xì)胞色素P450研究成功，發(fā)現(xiàn)小麥P450能解毒和促進(jìn)代謝和氧化等。Cabello-Hurtado等人從小麥中提取了編碼鈍葉醇的CYP51基因，酵母中表達(dá)該基因，能增強(qiáng)羊毛甾去甲基化的活性[2]。Forthoffer等人研究認(rèn)為，有3個(gè)及以上的P450參與了除草機(jī)解毒過(guò)程，除草劑的毒性能提升P450的活性[3]。小麥中的一個(gè)P450基因和赤霉病的抗性也有著密切的聯(lián)系，這個(gè)P450基因在抗性品種中的表達(dá)量非常高，說(shuō)明P450基因?qū)τ谛←溄舛竞头烙鹬e極的效應(yīng)。

2 試驗(yàn)材料和方式

2.1 試驗(yàn)材料

本次研究材料選擇某小麥品種，使用Trizol試劑盒，RACE試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司），從Fermentas公司購(gòu)入反轉(zhuǎn)錄試劑，另外試驗(yàn)用到的Ex Taq酶、pMD18-T載體從Transgen公司購(gòu)入。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 提取小麥基因組DNA和總RNA

使用Trizol方法提取小麥葉片中的RNA，使用CTAB方法提取基因組中的DNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得出完整的cDNA鏈，并將其在-20℃的環(huán)境下保存。

2.2.2 克隆TaP450基因

使用已知的小麥P450基因序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，將得出的序列進(jìn)行拼接比對(duì)，獲取到68個(gè)Contig，選出和已知小麥P450基因差異較大的序列研究。研究中將該拼接序列作為模板，并設(shè)計(jì)引物TaP450-S和TaP450-A，其中TaP450-S的序列為5'-CCTCTTCCTGCTCCACTACA-3'；TaP450-A 引 物的 序 列 為5'-GCCTTATTACGCCAACAACGC-3'[4]。用小麥葉片cDNA作為模板進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。在94℃下預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，75℃延伸10min，對(duì)目的條帶連接pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序，依照測(cè)試結(jié)果設(shè)計(jì)5'-RACE引物和3'-RACE引物，進(jìn)行RACE擴(kuò)增，連入pMD18-T進(jìn)行載體測(cè)序，拼接獲得TaP450基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

2.2.3 TaP450基因生物信息學(xué)分析和基因組序列克隆

使用ExPASy軟件，對(duì)TaP450基因編碼蛋白的分子量等進(jìn)行分析。在對(duì)Ta基因組序列進(jìn)行克隆時(shí)，以小麥葉片中基因組DNA作為模板，使用引物TaP450-gS（序列：5'-AGAAGAGATGAACCACGAA-3'）以及TaP450-gA（序列：5'-GCCTTATTACGCCAACAAGC-3'）進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，反應(yīng)程序是94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，53℃時(shí)退火30s，72℃時(shí)延伸5min，30個(gè)循環(huán)，72℃時(shí)延伸10min。將擴(kuò)增片段連入到pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序，從而獲得TaP450的基因組序列[5]。

2.2.4 TaP450組織特異性表達(dá)和脅迫處理表達(dá)

將小麥葉子、莖部、根部以及種子的總RNA提取，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用小麥Actin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)TaP450在小麥不同部位的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)TaP450進(jìn)行脅迫處理時(shí)，選用狀態(tài)一致小麥，使用200mmol/L的NaCl浸泡24h，20%的PEG6000浸泡24h，用100μmol/L的ABA葉面噴施，恢復(fù)生長(zhǎng)24h。損傷葉子恢復(fù)生長(zhǎng)24h。提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，檢測(cè)TaP450在多種脅迫下的相對(duì)表達(dá)量[6]。

2.2.5 半定量RT-PCR檢測(cè)

用小麥的Actin作為內(nèi)參，使用TaActin-S（序列：5'-AGCCATACCGTGCCAATC-3'）和引物TaActin-A（序列：5'-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3'），反應(yīng)程序是94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，經(jīng)過(guò)28個(gè)循環(huán)后在72℃下延伸10min，根據(jù)TaP450基因設(shè)計(jì)引物TaP450-RTS（序列：5'-ATGTCAGAGGAGGCCCAGGAGTTCA-3'）和引物TaP450-RTA（序列：5'-ATGTCAGAGGAGGC CCAGGAGTTCA-3'），實(shí)施組織器官表達(dá)和脅迫處理表達(dá)，反應(yīng)程序在94℃下預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，經(jīng)過(guò)28個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸 10min。

3 結(jié)果與分析

3.1 TaP450基因克隆和序列分析

PCR擴(kuò)增后得到長(zhǎng)為1546bp的目的條段，這片段序列和拼接序列大致相同，存在3個(gè)堿基差異。對(duì)5'-RACE和3'-RACE擴(kuò)增后將三條序列拼接，得到長(zhǎng)為2033bp的DNA片段，這個(gè)片段有長(zhǎng)度為1557bp的開(kāi)放讀碼框，有polyA尾[7]。

3.2 TaP450編碼蛋白生物信息

TaP450基因編碼蛋白中的氨基酸數(shù)量有518個(gè)，分子量是57.092kD，等電點(diǎn)是8.63。TaP450蛋白N端有長(zhǎng)度29的氨基酸跨膜結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度22的氨基酸信號(hào)鈦。通過(guò)分析得出該蛋白是分泌蛋白，和已知的P450蛋白比對(duì)，該蛋白和已知的P450蛋白的氨基酸序列不同，存在著很大差異，序列相似性低。

3.3 TaP450基因組序列克隆分析

用小麥基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為2643bp的DNA片段。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)基因組序列中有長(zhǎng)度為1086 bp的內(nèi)含子，兩個(gè)外顯子的長(zhǎng)度分別為942bp和615bp。

3.4 TaP450基因特異性表達(dá)和脅迫表達(dá)

經(jīng)過(guò)分析后發(fā)現(xiàn)，TaP450基因在小麥中的多個(gè)部位都有表達(dá)，其中在小麥的葉片中的表達(dá)量最高，在小麥的根部的表達(dá)量較低。脅迫表達(dá)分析方面，設(shè)置了不同的脅迫條件，對(duì)不同環(huán)境下TaP450表達(dá)量變化作出了檢測(cè)。通過(guò)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的研究，發(fā)現(xiàn)TaP450在受到鹽、機(jī)械損傷后，表達(dá)量出現(xiàn)明顯的上調(diào)。經(jīng)過(guò)PEG6000以及冷處理時(shí)，表達(dá)量的變化不明顯[8]。對(duì)比得出結(jié)論，說(shuō)明TaP450基因?qū)}、機(jī)械損傷等比較的敏感，對(duì)冷處理等不敏感。不同脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)TaP450基因?qū)}脅迫最為敏感，得出TaP450基因和鹽脅迫的關(guān)系密切。

4 結(jié)語(yǔ)

P450作為一種氧化酶，有著強(qiáng)大的功能，能促進(jìn)小麥的新陳代謝，并有著解毒的功效。本次研究中從小麥中提取了一個(gè)新的P450基因——TaP450，這個(gè)新的TaP450基因和已知的P450基因存在著較大的差異性，并且TaP450基因在小麥的各個(gè)部位都有表達(dá)，其中在小麥的葉片和頸部的含量最高，在種子以及根部的表達(dá)量較低。受到多種環(huán)境脅迫時(shí)，發(fā)現(xiàn)TaP450基因?qū)C(jī)械損傷在鹽脅迫下的表達(dá)量上調(diào)較為明顯，其中以在鹽脅迫下的表達(dá)最為顯著，說(shuō)明了TaP450基因和逆境脅迫相關(guān)。研究中，TaP450基因在水楊酸處理下上調(diào)，表明了該基因在一定程度上能增強(qiáng)小麥的抗病性。通過(guò)對(duì)小麥的蛋白序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TaP450蛋白N端的信號(hào)鈦，證明了屬于分泌蛋白。對(duì)TaP450基因的克隆和表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了新的P450成員，為增強(qiáng)小麥的抗逆性提供了幫助。