真菌誘導(dǎo)子在長(zhǎng)春花培養(yǎng)體系中的應(yīng)用

梁楚欣，于榮敏，朱建華

（暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632）

長(zhǎng)春花[Catharanthus roseus(L.) Don]為夾竹桃科長(zhǎng)春花屬多年生藥用植物。迄今已從長(zhǎng)春花中分離得到生物堿達(dá)130余種，大多數(shù)為萜類吲哚生物堿（terpenoid indole alkaloid，TIA）[1]。部分TIA具有明顯的生物活性并廣泛地應(yīng)用于各種疾病的治療，如長(zhǎng)春堿（vinblastine）和長(zhǎng)春新堿（vincristine）廣泛應(yīng)用于何杰金氏病、惡性淋巴腫瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病等疾病的治療[2]。該類抗腫瘤藥物主要從長(zhǎng)春花葉中提取分離獲得[3]。然而，這些化合物在植物中含量極微，且化學(xué)合成和半合成成本太高，如何提高長(zhǎng)春花中TIA產(chǎn)量成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)[4]。

在植物科學(xué)中，誘導(dǎo)子（elicitor）是指在植物抗病生理過(guò)程中誘發(fā)植物產(chǎn)生植物抗毒素和引起植物過(guò)敏反應(yīng)（hypersensitive reaction，HR）或自身防御反應(yīng)（self-defense reaction）的因子[5]。誘導(dǎo)子可來(lái)源于植物、真菌、細(xì)菌等多種生物，根據(jù)其來(lái)源可分為生物誘導(dǎo)子（biotic elicitor）和非生物誘導(dǎo)子（abiotic elicitor），生物誘導(dǎo)子主要包括植物細(xì)胞成分及病原菌即細(xì)菌、真菌與病毒，而非生物誘導(dǎo)子則包括能起誘導(dǎo)作用的金屬離子和無(wú)機(jī)物[6-8]。

近年，越來(lái)越多的研究表明真菌誘導(dǎo)子（fungal elicitor）在調(diào)控生物次生代謝途徑及細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)等方面有重要作用。在提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的研究中，用真菌誘導(dǎo)子處理植物細(xì)胞培養(yǎng)體系已成為快速提高植物細(xì)胞培養(yǎng)物中目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的有效方法之一[7,9]。本文主要涉及真菌誘導(dǎo)子的簡(jiǎn)介，以及真菌誘導(dǎo)子在長(zhǎng)春花培養(yǎng)體系中的研究進(jìn)展

1 真菌誘導(dǎo)子的發(fā)現(xiàn)與概述

1968年，Cruickshank等[10]從叢梗孢科鏈核盤屬鏈合盤菌Monilinia fructicola的菌絲體中分離得到一種多肽——鏈核盤素A（monilicolin A），并將其加入菜豆細(xì)胞培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)monilicolin A能誘導(dǎo)菜豆果皮的形成和菜豆素（phaseollin）的積累。Monilicolin A作為首個(gè)被報(bào)道的真菌誘導(dǎo)子，使得真菌作為一種新型誘導(dǎo)子在植物與真菌相互作用的病理學(xué)機(jī)制及提高藥用植物次生代謝物產(chǎn)量等研究領(lǐng)域中受到了廣泛關(guān)注。

真菌誘導(dǎo)子是來(lái)源于真菌的一類活性物質(zhì)，能快速、專一地誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá)，從而活化特定次生代謝途徑，使目的次生代謝產(chǎn)物的積累量增加[9]。值得注意的是，用于制備誘導(dǎo)子的真菌，既可以是植物致病性的或內(nèi)源性的，也可以是與植物完全無(wú)關(guān)的真菌。真菌誘導(dǎo)子的組分主要包括真菌的菌絲體、菌絲體降解產(chǎn)物、真菌分泌物等，而化學(xué)成分一般為多糖、寡糖、多肽和蛋白質(zhì)等[11]。上述化學(xué)成分與信號(hào)分子的傳導(dǎo)過(guò)程密切相關(guān)。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，真菌誘導(dǎo)子首先與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合并被植物細(xì)胞識(shí)別，然后通過(guò)各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑使植物基因的表達(dá)發(fā)生變化，從而使植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中相關(guān)酶的活性受到調(diào)節(jié)，最終引起植物細(xì)胞產(chǎn)生防御反應(yīng)并促進(jìn)特定次生代謝產(chǎn)物的生成和積累[12]。

目前，該類誘導(dǎo)子主要應(yīng)用于植物和微生物細(xì)胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物兩個(gè)方面，在提高藥用植物培養(yǎng)物中天然產(chǎn)物的產(chǎn)率方面取得較為明顯的進(jìn)展。在藥用植物培養(yǎng)中，人們利用不同的真菌誘導(dǎo)子實(shí)現(xiàn)了萜類、生物堿類、皂苷類、黃酮類及多酚類等多種化合物的誘導(dǎo)合成及產(chǎn)量提高[4,7,12-14]。真菌誘導(dǎo)子雖能很好地調(diào)控次生代謝物的產(chǎn)量，但其誘導(dǎo)效果因真菌種類、誘導(dǎo)子組分、劑量、加入時(shí)間及植物細(xì)胞培養(yǎng)物的種類等因素的不同而有所差異[15-17]。

2 真菌誘導(dǎo)子在長(zhǎng)春花培養(yǎng)體系中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 利用真菌誘導(dǎo)子提高次生代謝物的產(chǎn)量

長(zhǎng)春花中多數(shù)吲哚類生物堿具有重要的生物活性，但這些有效成分的含量較低，且化學(xué)合成和半合成成本昂貴。因此，人們開始致力于提高長(zhǎng)春花中生物堿的含量。而真菌誘導(dǎo)子以其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，成為提高長(zhǎng)春花中TIA含量的其中一種重要手段[18-19]。

Zhao等[20-21]利用真菌誘導(dǎo)子與化學(xué)試劑聯(lián)合處理長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞的方法，先后提高了細(xì)胞中阿嗎堿（ajmalicine）和長(zhǎng)春質(zhì)堿（catharanthine）的產(chǎn)量。隨后，Namdeo等[22]證實(shí)黑曲霉（Aspergillus niger）、串珠鐮孢（Fusarium moniliforme）和綠色木霉（Trichoderma viride）真菌誘導(dǎo)子能有效地提高長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞中阿嗎堿的產(chǎn)量，且阿嗎堿的產(chǎn)量與誘導(dǎo)子的劑量呈一定相關(guān)性。石岳香等[23]將鐮刀菌屬內(nèi)生真菌F9作用于長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系后，發(fā)現(xiàn)該真菌及其誘導(dǎo)子能影響長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)率，導(dǎo)致細(xì)胞代謝結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并使生物堿的產(chǎn)量得以提高。

然而，真菌誘導(dǎo)子對(duì)長(zhǎng)春花生物堿合成的誘導(dǎo)效果不僅與真菌的種類、誘導(dǎo)子的劑量有關(guān)，還與誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)短以及植物細(xì)胞培養(yǎng)物的種類等多種因素相關(guān)。這促使國(guó)內(nèi)外學(xué)者加深了在這些方面的研究。用來(lái)自12種不同真菌的誘導(dǎo)子對(duì)長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)后，Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)10 mg/L稻曲霉（Ustilaginodia verens）誘導(dǎo)子和20 mg/L黑曲霉（Aspergillum niger）誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效果最好；誘導(dǎo)子的處理時(shí)間以2～4 d為宜，時(shí)間太短則效果不明顯，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)抑制生物堿合成并造成細(xì)胞死亡。張向飛等[24]則用分別來(lái)源于鐮刀菌（Fusarium solani）和Aspergillum niger的真菌誘導(dǎo)子，對(duì)長(zhǎng)春花愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)處理。他們發(fā)現(xiàn)，上述兩種真菌誘導(dǎo)子對(duì)吲哚總堿及阿嗎堿和長(zhǎng)春質(zhì)堿的積累均有明顯的正向調(diào)節(jié)作用，并確立了真菌誘導(dǎo)子的最佳處理時(shí)間。

除上述研究以外，還有Shukla等[3]用瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）勻漿分別對(duì)長(zhǎng)春花試管苗、愈傷組織和懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，并設(shè)定誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為8 h、16 h和24 h，誘導(dǎo)后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)生物堿的含量及SGD和DAT基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，P. aphanidermatum勻漿不僅能使長(zhǎng)春花試管苗、愈傷組織和懸浮細(xì)胞中總生物堿的含量日益增加，還能使SGD和DAT基因的表達(dá)上調(diào)。此外，在長(zhǎng)春花試管苗和愈傷組織中，該真菌誘導(dǎo)子還能誘導(dǎo)長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈（vindoline）的合成與積累。Tonk等[15]用不同濃度的黃曲霉（Aspergillus flavus）誘導(dǎo)子處理胚性長(zhǎng)春花愈傷組織，并對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)率、植胚及植株再生率及生物堿（長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿）含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，低劑量的真菌誘導(dǎo)子既能有效地提高愈傷組織生長(zhǎng)率、植胚數(shù)、萌芽率及長(zhǎng)春花植胚中的生物堿含量，也能增加胚苗和胚根的長(zhǎng)度。進(jìn)一步檢測(cè)抗氧化物酶活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)子處理后，初生和成熟的長(zhǎng)春花植胚中超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯升高；由此可認(rèn)為低劑量的A. flavus誘導(dǎo)子使長(zhǎng)春花的晚期植胚產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，從而導(dǎo)致生物堿的含量有所提升。

在研究真菌誘導(dǎo)子對(duì)長(zhǎng)春花TIA產(chǎn)量影響的同時(shí)，人們也對(duì)長(zhǎng)春花的其他次生代謝物進(jìn)行深入研究。Frankmann和Kauss[25]發(fā)現(xiàn)在P. aphanidermatum真菌誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)下，阿嗎堿的含量在誘導(dǎo)初期有所提高，并且長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞中會(huì)積累2, 3-二羥基苯甲酸 （2,3-dihydroxy benzoic acid，DHBA）。與此同時(shí)，Moreno等[26]用P. aphanidermatum真菌誘導(dǎo)子處理長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞和幼苗后也發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞還是在長(zhǎng)春花幼苗中，都會(huì)有DHBA在細(xì)胞內(nèi)大量累積；而且，DHBA的積累量與異分支酸合酶（isochorismate synthase，ICS）的誘出量呈正相關(guān)。幾年后，Muljono等[27]繼續(xù)利用P. aphanidermatum誘導(dǎo)子研究長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞中產(chǎn)生的DHBA是否來(lái)自水楊酸（salicylic acid，SA）。結(jié)果顯示，雖然SA不太可能是DHBA的直接前體物質(zhì)，但它很可能在DHBA生物合成途徑中起著調(diào)控作用。

2.2 真菌誘導(dǎo)子的作用機(jī)制

除了研究如何提高長(zhǎng)春花中特定生物堿含量，人們還利用真菌誘導(dǎo)子來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)機(jī)制方面的研究。

上世紀(jì)八九十年代，Eilert等[28]用P.aphanidermatum誘導(dǎo)子處理長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)色氨酸脫羧酶（tryptophan decarboxylase，TDC） 和異胡豆苷合酶（strictosidine synthase，SS）的酶活力被瞬間激發(fā)；Roewer等[29]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酶活力被瞬間激發(fā)是因?yàn)镻. aphanidermatum誘導(dǎo)子導(dǎo)致了上述兩種酶基因的瞬時(shí)表達(dá)。后來(lái)，在利用聯(lián)合誘導(dǎo)法提高長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的同時(shí)，Zhao等[30]還通過(guò)黑曲霉誘導(dǎo)子，發(fā)現(xiàn)在懸浮細(xì)胞中真菌誘導(dǎo)子對(duì)吲哚生物堿生物合成的誘發(fā)作用與Ca2+內(nèi)流及氧化爆發(fā)（oxidative burst）密切相關(guān)。Xu和Dong[17]利用分離自真菌橘青霉（Penicillium citrinum）細(xì)胞壁的誘導(dǎo)子及NO特異清除劑 1,3-PBITU二氫溴酸鹽（S,S’-1,3-phenylenebis(1,2-ethanediyl) -bis-isothiourea，PBITU）處理長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞。研究結(jié)果說(shuō)明，真菌誘導(dǎo)子能誘導(dǎo)長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞中的一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）和一氧化氮合成樣酶（NOS-like enzyme）合成NO，而細(xì)胞中NO的存在則是誘導(dǎo)長(zhǎng)春質(zhì)堿合成的關(guān)鍵。與此同時(shí)，他們還利用黑曲霉細(xì)胞壁誘導(dǎo)子處理長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞，闡述了從氧化反應(yīng)中間產(chǎn)物（reactive oxygen intermediate，ROI）的產(chǎn)生到苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）的激活，及導(dǎo)致長(zhǎng)春質(zhì)堿合成的一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。值得注意的是，觸發(fā)后續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的ROI是O2-而不是H2O2[31]。

隨后，Tang等[32]從長(zhǎng)春花中分離出屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumSchlecht）的內(nèi)生真菌F9，并作用于長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，證實(shí)在真菌誘導(dǎo)子的作用下，懸浮細(xì)胞迅速作出應(yīng)答，某些與清除自由基過(guò)程相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活，某些特定的次生代謝途徑被打開或增強(qiáng)。且經(jīng)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子處理后，長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞中PAL和TDC的活性及生物堿的含量獲得顯著提高。

為闡明真菌誘導(dǎo)子調(diào)控藥用植物活性成分生物合成的作用機(jī)制，Chen等[33]將分離自真菌苧麻疫霉（Phytophthora boehmeriae）的蛋白PB90作為真菌誘導(dǎo)子。該研究發(fā)現(xiàn)，用PB90處理長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞后，細(xì)胞中脫落酸（ABA）和NO含量迅速增加，而細(xì)胞中的兩個(gè)重要的長(zhǎng)春質(zhì)堿生物合成基因Str和Tdc的表達(dá)也隨之受到促進(jìn)，長(zhǎng)春質(zhì)堿的含量增至20 mg/L即原來(lái)的4倍；分別用ABA抑制劑和NO清除劑處理經(jīng)真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞時(shí)，Str和Tdc的表達(dá)及長(zhǎng)春質(zhì)堿的生物合成卻受到抑制。由此可見ABA和NO在誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的長(zhǎng)春質(zhì)堿生物合成中起著至關(guān)重要的作用。進(jìn)一步研究表明，在由PB90誘發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，ABA在NO的上游發(fā)揮作用。

其后，人們進(jìn)一步在基因水平上對(duì)真菌誘導(dǎo)子的調(diào)控作用進(jìn)行解釋。Pandey等[4]發(fā)現(xiàn)分離自長(zhǎng)春花葉片的內(nèi)生真菌Curvularia sp. CATDLF5和Choanephora infundibuliferaCATDLF6對(duì)長(zhǎng)春花的初級(jí)代謝不產(chǎn)生影響，但能使長(zhǎng)春花植株中文多靈的含量增加約2～4倍。qPCR結(jié)果顯示，經(jīng)上述內(nèi)生誘導(dǎo)子處理后，長(zhǎng)春花TIA途徑中關(guān)鍵酶基因G10H、TDC、STR、16OMT、D4H、DAT、PRX1及轉(zhuǎn)錄激活因子基因ORCA3的表達(dá)均有所上調(diào)，而轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ZCT的表達(dá)卻受到抑制；根據(jù)qPCR結(jié)果推斷，長(zhǎng)春花植株中文多靈的含量增加，是因?yàn)閮?nèi)生真菌誘導(dǎo)子可特異地調(diào)控文多靈生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)。

3 結(jié)語(yǔ)和展望

生物堿是存在于藥用植物中的一類含氮雜環(huán)化合物，在疾病治療中發(fā)揮重要作用。然而，來(lái)源于長(zhǎng)春花的生物堿含量往往很低，且長(zhǎng)春花植物資源有限，嚴(yán)重影響其在藥用方面的開發(fā)利用。雖然半合成、發(fā)酵或基因工程等手段在提高生物堿產(chǎn)量方面均顯示出巨大潛力，但限于成本偏高及環(huán)境污染等問(wèn)題，從藥用植物細(xì)胞中提取生物堿仍然是當(dāng)前獲取生物堿的主要來(lái)源[34]?，F(xiàn)有研究證明真菌誘導(dǎo)子能快速、專一地誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá)，從而活化特定次生代謝途徑、使目的次生代謝產(chǎn)物的積累量增加。因此，利用真菌誘導(dǎo)子提高長(zhǎng)春花生物堿含量具有重大意義。

從已有研究可知，通過(guò)調(diào)整真菌誘導(dǎo)子的真菌種類、誘導(dǎo)子的劑量、誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)短及植物細(xì)胞培養(yǎng)物的種類等因素，可有效地提高長(zhǎng)春花生物堿的產(chǎn)量。此外，通過(guò)真菌誘導(dǎo)子對(duì)長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理，人們還對(duì)真菌誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了初步研究，并取得可喜進(jìn)展。

但目前真菌誘導(dǎo)子在長(zhǎng)春花細(xì)胞的應(yīng)用主要集中于由愈傷組織（callus）繼代培養(yǎng)而成的長(zhǎng)春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞體系。愈傷組織又被稱為脫分化細(xì)胞，是指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的組織；而干細(xì)胞（stem cell），則是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始的未分化細(xì)胞。與脫分化細(xì)胞對(duì)比，干細(xì)胞在生長(zhǎng)率、穩(wěn)定性、次生代謝物含量等方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性[35]。藥用植物干細(xì)胞培養(yǎng)作為一種新技術(shù)，為解決傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)遇到的問(wèn)題提供了一個(gè)全新的解決方案[36]。隨著藥用植物干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的完善與發(fā)展，如果將真菌誘導(dǎo)子與該技術(shù)結(jié)合起來(lái)，將會(huì)極大地推動(dòng)真菌誘導(dǎo)子在調(diào)控藥用植物次生代謝產(chǎn)物含量方面的研究進(jìn)程。