阿帕替尼對急性單核細(xì)胞SHI-1生長抑制作用及VEGF表達(dá)的影響

黃露迷 熊雙龍 王春梅 冀曉輝 王東林 李代蓉（通訊作者）

（重慶市腫瘤研究所/醫(yī)院/癌癥中心腫瘤內(nèi)科 重慶 400030）

阿帕替尼為口服型VEGFR-2酪氨酸激酶抑制劑的一種，其在2014年在中國上市。這種藥物在治療晚期胃癌和胃食管交界癌中有著明顯效果[1]。其在延長諸如晚期肝癌、乳腺癌以及胃癌等類型疾病患者無進(jìn)展生存期方面，有著滿意效果，但將其用于治療白血病方面，報道不多。結(jié)合實際情況，本文章全面分析阿帕替尼對急性單核細(xì)胞SHI-1生長抑制作用及VEGF表達(dá)的影響，現(xiàn)將具體結(jié)果報告如下。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

擇取SHI-1細(xì)胞株，來源于一例急性單核細(xì)胞白血病AMLM5b患者。樣本在-80℃環(huán)境下封存。實驗試劑為：RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、阿帕替尼（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司出品）。胎牛血清生產(chǎn)廠家為杭州四季青生物工程材料有限公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT），使用前，將其在PBS內(nèi)制成5ml/Ml，后在4℃環(huán)境下保存，二甲基亞砜（DMSO）、VEGF ELISA試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 阿帕替尼對SHI-I細(xì)胞毒性情況

設(shè)立陰性對照、空白對照和實驗組三組，在空白組內(nèi)加入100μL RPMI1640培養(yǎng)基；陰性組內(nèi)接種SHI-1細(xì)胞；實驗組在陰性組基礎(chǔ)上，同時加入不同濃度的阿帕替尼。每種濃度設(shè)立三個復(fù)孔。

SHI-1細(xì)胞為對數(shù)期，密度2×105/mL，100μL。在孔板內(nèi)孵育24、48h后取出。每孔內(nèi)加入20μLMTT，后繼續(xù)孵育。4h后吸取上清液，每孔內(nèi)加入DMSO，振蕩處理10min。將孔板放在酶標(biāo)儀內(nèi)，測定OD值，后計算細(xì)胞存活率以及半數(shù)抑制率。

1.2.2 SHI-1細(xì)胞VEGF表達(dá)量

選擇對數(shù)期細(xì)胞，開展離心，計數(shù)。將其加入到培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞數(shù)為2×105/mL/孔。加入不同濃度阿帕替尼，繼續(xù)孵育，作用24h以及48h。收集培養(yǎng)上清，結(jié)合試劑盒方法，測定經(jīng)作用后SHI-1細(xì)胞株培養(yǎng)上清VEGF表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)原理

實驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗3次平行測定值的平均值，并采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析，計量資料用（±s）表示，多個樣本均數(shù)之間比較采用方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD法，兩兩樣本均數(shù)之間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 阿帕替尼對SHI-1細(xì)胞毒性

阿帕替尼在5、10、20、40、80、160、320、640ng/mL的濃度范圍內(nèi)，對SHI-1細(xì)胞株增殖有明顯的細(xì)胞生長抑制作用，作用24h與48h后，IC50分別為157.306±2.1ng/mL、92.509±1.9ng/mL。隨著阿帕替尼濃度及作用時間的增加，對SHI-1細(xì)胞的毒性作用更強，在320ng/mL時細(xì)胞的抑制率達(dá)75%。確定給藥濃度為5、20、40、80ng/mL，進(jìn)行下述實驗。

2.2 阿帕替尼對SHI-1細(xì)胞VEGF分泌影響情況

SHI-1細(xì)胞過度表達(dá)VEGF，使用阿帕替尼處理24h以及48h后，當(dāng)濃度為5ng/ml時，其和空白組的VEGF表達(dá)量無明顯差異。當(dāng)為20ng/mL時VEGF量明顯比空白組高，給藥濃度和SHI-1細(xì)胞VEGF分泌呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，當(dāng)給藥量為80ng/ml時，和空白組相比存在統(tǒng)計學(xué)意義，作用時間和VEGF表達(dá)量呈現(xiàn)反比。藥物濃度在40、80ng/mL時，24h組和48h存在差異，P＜0.05.詳見表。

表 不同濃度阿帕替尼作用下SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF表達(dá)量（±s，n=9）

表 不同濃度阿帕替尼作用下SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF表達(dá)量（±s，n=9）

不同濃度阿帕替尼（ng/mL） SHI-1細(xì)胞培24h 0 978.1±3 5 943.2±1養(yǎng)上清VEGF表達(dá)量（pg/mL）48h.1 981.3±3.3.8 938.3±1.7 20 504.3±1.7 460.9±1.6 40 348.8±1.5 232.7±1.7 80 237.2±2.5 143.5±2.7

3.討論

急性白血病為臨床常見病。其為經(jīng)造血干細(xì)胞分化阻滯以及凋亡障礙以及不良增殖引起的單克隆特異性疾病。有文獻(xiàn)指出，阿帕替尼對HL-60細(xì)胞增殖有抑制作用，并可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。對于FLT3-ITD陽性的AML患者，使用索拉菲尼治療能取得一定成效。體內(nèi)體外報道指出，將靶向藥物應(yīng)用在急性白血病治療中，前景廣闊[2]。

血管新生受到諸多因子調(diào)控，而VEGF為典型代表。癌細(xì)胞內(nèi)可能存在VEGF的自我分泌機制，其通過和VEGFR-2結(jié)合，加強血管通透性，加速腫瘤細(xì)胞增殖。。阿帕替尼能夠競爭性的和VEGFR-2結(jié)合，繼而起到減少VEGF與其結(jié)合的機會，且能抑制VEGFR-2磷酸化，進(jìn)而阻斷下游信號傳導(dǎo)。減少血管新生。當(dāng)前諸多實驗證實，其在治療多種癌癥方面，具有一定效果[3]。

本實驗使用急性單核細(xì)胞白血病SHI-1細(xì)胞株為研究對象，并以MTT法對阿帕替尼對于SHI-1細(xì)胞株的毒性進(jìn)行分析，結(jié)果證實，該藥物對于SHI-1細(xì)胞株有著一定殺傷性，且對于SHI-1細(xì)胞的抑制作用和濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)320ng/mL時細(xì)胞的抑制率達(dá)75%。同時測定阿帕替尼作用后SHI-1細(xì)胞株培養(yǎng)上清VEGF含量，比較有無阿帕替尼作用培養(yǎng)上清VEGF含量的變化，結(jié)果表明，無阿帕替尼作用培養(yǎng)上清中VEGF量明顯高于作用后，阿帕替尼能顯著降低白血病細(xì)胞VEGF的表達(dá)量。

[1]陳蘇寧,薛永權(quán),吳亞芳,等.人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系SHI-1的多藥耐藥和耐藥蛋白的表達(dá).江西醫(yī)藥,2007,10(33):1015-1017.

[2]朱興虎,夏學(xué)鳴,李建勇.急性單核細(xì)胞白血病的細(xì)胞生物學(xué)特性與療效的關(guān)系.臨床血液學(xué)雜志,2001,14(6):263-264.

[3]秦叔逵,李進(jìn).阿帕替尼治療胃癌的臨床應(yīng)用專家共識[J].臨床腫瘤學(xué)雜志2015,09:841-847.