基于Fem AB基因特異引物的動(dòng)物雙歧桿菌PCR檢測(cè)方法的建立

溫學(xué)鵬，祁昊，郭思圻，王哲，高學(xué)軍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0　引 言

雙歧桿菌屬細(xì)菌是人與動(dòng)物機(jī)體內(nèi)常見的細(xì)菌之一，對(duì)改善機(jī)體內(nèi)的菌群平衡、免疫能力等方面具有重要的價(jià)值[1]。

分子生物學(xué)的PCR鑒定技術(shù)如今廣泛的應(yīng)用于微生物的分類與鑒別，亦可用于雙歧桿菌的鑒定[2]。雙歧桿菌屬內(nèi)各個(gè)種中，常用于PCR鑒定的保守基因的相似度均很高，少數(shù)種相似度極高[3]，難以設(shè)計(jì)鑒定用特異引物，所以，尋找保守度較低一些的基因序列來設(shè)計(jì)特異引物是一個(gè)不錯(cuò)的解決方法，例如SodA基因可用于好氧細(xì)菌的PCR鑒定的特異引物設(shè)計(jì)之中[4]。

本實(shí)驗(yàn)分離了兩株雙歧桿菌，并以動(dòng)物雙歧桿菌中編碼肽聚糖肽橋形成蛋白（Peptidoglycan bridge form ation protein）的Fem AB基因設(shè)計(jì)了特異引物行了鑒定實(shí)驗(yàn)，為Fem AB基因用于PCR菌種鑒定的可行性以及動(dòng)物雙歧桿菌的鑒定供了數(shù)據(jù)參考。

1　實(shí) 驗(yàn)

1.1　材料

（1）實(shí)驗(yàn)菌株。實(shí)驗(yàn)所用雙歧桿菌菌株、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌株分離自某些益生菌藥品制劑；兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌和青春雙歧桿菌菌株，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

（2）培養(yǎng)基。M RS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、醋酸鈉5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，加蒸餾水配至1 L。固態(tài)培養(yǎng)基加2.0%瓊脂。

（3）儀器與試劑。PCR反應(yīng)儀（T-Gradient 96 Therm oblock Modul，Biometra），凝膠成像系統(tǒng)等，DN A提取試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA，回收試劑盒等。

1.2　方法

1.2.1菌種的分離純化

采用平板劃線法對(duì)菌株進(jìn)行分離。培養(yǎng)溫度采用37℃，培養(yǎng)時(shí)間為2-3 d。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色并于鏡下觀察，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒別。反復(fù)若干次劃線分離后取得單一形態(tài)菌落接至液態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基變渾濁后取樣，革蘭氏染色，鏡檢，并于-80℃凍存。

1.2.2PCR模版的制備

將純化后菌接種于M RS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。待菌液渾濁度適合時(shí)，離心沉淀菌體并用緩沖液離心洗滌菌體2次后，使用試劑盒提取其基因組DN A。提取方法按照回收試劑盒說明書進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)用菌株的DN A模板提取方法均一致。

1.2.3菌種的鑒定

（1）兩株雙歧桿菌的16S rDNA通用引物鑒定[5]。使用通用引物27F1492R（F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行屬分類水平的PCR分析鑒定。

（2）兩株雙歧桿菌的非特異隨機(jī)引物鑒定。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢相關(guān)信息，根據(jù)雙歧桿菌屬內(nèi)菌種的全基因組序列情況進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)一對(duì)隨機(jī)擴(kuò)增引 物（XF：CTGTCGACTATGTGGGTGTCA，XR：CCTCGGTGATGCGGATGTTC），并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及片段回收測(cè)序。

PCR體系：25μL體系，DMSO 2.5μL，10×Easy-Taq Bu ffer 2.5μL，dN TP M ixture 2.0μL，模板DN A 1.0μL，引物F為1μL，引物R為1μL，EasyTaq DN A聚合酶0.25μL，滅菌蒸餾水14.75μL。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，最后72℃終延伸10 min。

（3）動(dòng)物雙歧桿菌Fem AB特異引物在屬分類水平的特異性檢測(cè)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢相關(guān)信息，根據(jù)動(dòng)物雙歧桿菌Fem AB基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物（F：GGTTCGCCAAGGACATGAC，R：GATGCCGTAGAAGTCGTACAG）。然后，先對(duì)非雙歧桿菌屬的幾種革蘭氏陽性菌DNA樣品使用相對(duì)應(yīng)的種水平特異性引物[6-9]進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，然后使用這幾種鑒定無誤的革蘭氏陽性菌作為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)Fem AB特異引物在屬分類水平的特異性。

PCR體系：25μL體系，DMSO 2.5μL，10×Easy-Taq Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2.0μL，模板DNA 1.0μL，引物F為1μL，引物R為1μL，EasyTaq DN A聚合酶0.25μL，滅菌蒸餾水14.75μL。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)25次，最后72℃終延伸10min。

（4）動(dòng)物雙歧桿菌Fem AB特異引物在種分類水平的特異性檢測(cè)。使用同為雙歧桿菌屬下其他種的兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）和青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）作為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)Fem AB特異引物在種分類水平的特異性。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系條件同（3）。

所有實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物送去測(cè)序。

2　結(jié) 果

2.1　兩株雙歧桿菌屬水平的16SrDNA通用引物鑒定

使用通用引物擴(kuò)增并測(cè)序所鑒定兩株菌種。結(jié)果表明兩株菌種均為雙歧桿菌屬。

2.2　兩株雙歧桿菌的非特異隨機(jī)引物鑒定

使用非特異隨機(jī)引物XF，XR對(duì)兩株雙歧桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖1，兩株雙歧桿菌都在約100、300、800和2000bp的區(qū)域出現(xiàn)了四條條帶。其中約800和約2000bp區(qū)域出現(xiàn)的條帶經(jīng)3，4泳道的條帶分析確認(rèn)為單引物擴(kuò)增條帶，約100區(qū)域有可能為引物二聚體，都不適合回收。

圖1　兩株雙歧桿菌非特異隨機(jī)引物擴(kuò)增結(jié)果

使用回收試劑盒回收約300 bp區(qū)域的片段后進(jìn)行測(cè)序，兩株雙歧桿菌所回收的兩條約300bp片段測(cè)序結(jié)果完全一致。測(cè)序結(jié)果的Blast結(jié)果如圖2所示。

圖2　兩株雙歧桿菌非特異隨機(jī)引物擴(kuò)增測(cè)序部分對(duì)比結(jié)果

經(jīng)NCBI的blast工具對(duì)比分析，此片段為編碼雙歧桿菌肽基脯氨酰異構(gòu)酶（peptidylpro lylisomerase）基因序列的部分區(qū)域，而且此片段只能與動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）的此基因（登錄號(hào)CP009045.1）達(dá)到99%以上相似度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確認(rèn)這兩株雙歧桿菌均為動(dòng)物雙歧桿菌。

2.3　PCR鑒定特異引物的目的基因Fem AB片段的選取與分析

革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，除肽聚糖主鏈以外，還有側(cè)鏈與肽橋。肽橋?yàn)楦锾m氏陽性菌所特有，它作為一個(gè)交聯(lián)的中間結(jié)構(gòu)使得革蘭氏陽性菌可以形成較革蘭氏陰性菌更致密的細(xì)胞壁。不同革蘭氏陽性菌的肽橋的結(jié)構(gòu)成分有較大的差異[10]，這提示與肽橋相關(guān)的蛋白的基因序列可能存在有較理想的種屬特異性[11]，有成為可以鑒定革蘭氏陽性菌的PCR特異引物的目的序列的潛力。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找動(dòng)物雙歧桿菌的肽橋合成蛋白的信息，通過其查找到相關(guān)的基因編碼信息（基因登錄號(hào)CP007755.1，354884-356167）。根據(jù)NCBI的Blast工具分析，這段序列在所有登錄在NCBI數(shù)據(jù)庫中的動(dòng)物雙歧桿菌的相似度達(dá)97%～100%，而與其它雙歧桿菌屬菌種的相似度均低于75%，而與雙歧桿菌屬以外的菌種相似性則均約在35%以下（圖3）。

圖3　動(dòng)物雙歧桿菌Fem AB基因的Blast工具對(duì)比的部分結(jié)果

使用DN AM AN軟件對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌與雙歧桿菌屬其它菌種的Fem AB基因序列進(jìn)行對(duì)比，其對(duì)比結(jié)果顯示，動(dòng)物雙歧桿菌的Fem AB基因約1300bp的序列與其他雙歧桿菌的此基因的同源性最高約75%，差異片段較分散地存在于整條序列中（圖4）。

圖4　幾種不同雙歧桿菌FemAB基因的DNAMAN工具同源性對(duì)比結(jié)果

上述幾項(xiàng)對(duì)比的結(jié)果顯示，動(dòng)物雙歧桿菌的Fem-AB基因序列與不同屬的革蘭氏陽性菌相比有著很大的差異，與其他同屬菌的Fem AB基因相比也有較明顯的差異。依此可以推測(cè)，F(xiàn)em AB基因序列有可能成為可在屬分類水平及種分類水平對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌進(jìn)行鑒定的PCR特異引物的目的序列。

2.4　動(dòng)物雙歧桿菌Fem AB特異引物在屬水平的特異性檢測(cè)

屎腸球菌（Enterococcus Faecium）特異引物擴(kuò)增結(jié)果如圖5（a），在約100～250bp的區(qū)段可見單一明亮的特異性條；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）特異引物擴(kuò)增結(jié)果如圖5（b），在約250～500bp的區(qū)段可見單一明亮的特異性條帶；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）特異引物擴(kuò)增結(jié)果如圖 5（c），在約100-250bp附近的區(qū)段可見單一明亮的特異性條帶；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）特異引物擴(kuò)增結(jié)果如圖5（d），在約1 000 bp附近的區(qū)段可見單一明亮的特異性條帶；兩株雙歧桿菌的特異引物擴(kuò)增如圖5（e），在約500～750bp的區(qū)段可見單一明亮的特異性條帶。

圖5　枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌與動(dòng)物雙歧桿菌特異引物擴(kuò)增結(jié)果

圖5中，M為DL2000M aker；1為屎腸球菌菌株；2為枯草芽孢桿菌菌株；3為保加利亞乳桿菌菌株；4為嗜熱鏈球菌菌株；5為雙歧桿菌菌株1號(hào)；6為雙歧桿菌菌株2號(hào)；7為無引物空白陰性對(duì)照。

圖5中，各個(gè)圖的作為陰性對(duì)照的菌株在各自的電泳圖中在陽性菌株的特異擴(kuò)增區(qū)域均無明顯與之相似擴(kuò)增條帶。兩株雙歧桿菌經(jīng)特異引物擴(kuò)增后所回收的兩條擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果幾乎完全一致。測(cè)序后Blast對(duì)比結(jié)果如圖6。

圖6　動(dòng)物雙歧桿菌特異引物擴(kuò)增測(cè)序部分對(duì)比結(jié)果

經(jīng)NCBI的blast工具對(duì)比，此片段測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致，與動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）的Fem AB基因（登錄號(hào)CP009045.1）達(dá)到99%以上相似度。結(jié)果表明，以Fem AB為模版設(shè)計(jì)的特異引物在屬分類水平上有著良好的特異性。

2.5　動(dòng)物雙歧桿菌Fem AB特異引物在種水平的特異性檢測(cè)

使用動(dòng)物雙歧桿菌特異引物對(duì)一株兩歧雙歧桿菌、一株短雙歧桿菌、兩株青春雙歧桿菌和本實(shí)驗(yàn)所分離的兩株動(dòng)物雙歧桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖7，只有兩株動(dòng)物雙歧桿菌泳道在約500-750bp處出現(xiàn)了特異擴(kuò)增條帶，其他作為陰性對(duì)照的其他雙歧桿菌均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明，以Fem AB為模版設(shè)計(jì)的特異引物在種分類水平上有著較好的特異性。

圖7　利用動(dòng)物雙歧桿菌Fem AB特異引物擴(kuò)增不同雙歧桿菌菌種結(jié)果

3　討 論

本實(shí)驗(yàn)所用的兩種市售益生菌制品的說明中寫明所用雙歧桿菌菌株分別為長(zhǎng)型雙歧桿菌（Bifidobacteria longuMSubsp.longum）和嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacteria longuMSubsp.infantis），本實(shí)驗(yàn)最初依據(jù)長(zhǎng)型雙歧桿菌的Fem AB基因序列設(shè)計(jì)的特異引物無任何擴(kuò)增片段出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)最后證明這兩株菌種并非長(zhǎng)型雙歧桿菌的兩個(gè)亞種菌株[12]，而是均為動(dòng)物雙歧桿菌。

在本研究鑒定菌種過程中借鑒了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)[13]。某些細(xì)菌及其近緣菌中，常用于鑒定的16SrDNA序列的相似度可能會(huì)很高，在種水平上難以對(duì)其進(jìn)行區(qū)分[14]。在細(xì)菌基因組中，有著較高同源性（≥90%）的保守序列實(shí)際上并不多，而大多數(shù)序列都是有帶有一定特異性甚至是完全特異的基因序列[15]。如果使用特異性不高的引物進(jìn)行近似于隨機(jī)的擴(kuò)增，其擴(kuò)增出帶有足夠分辨種屬的特異片段的概率實(shí)際上很高。

本研究中使用了針對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌的Fem AB這一基因序列設(shè)計(jì)特異引物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)em AB基因在屬分類水平與種分類水平上具有足夠的特異性可作為PCR種屬鑒定特異引物設(shè)計(jì)的目的片段。本實(shí)驗(yàn)使用以Fem AB為目的片段的特異引物成功建立了動(dòng)物雙歧桿菌的PCR檢測(cè)方法，為包括雙歧桿菌種屬在內(nèi)的其他革蘭氏陽性菌的PCR檢測(cè)方法的建立提供了新的思路與參考。

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