唾液乳桿菌Ls04對(duì)小鼠腸道菌群及黏膜SIgA質(zhì)量濃度的影響

郝薇，范彧，閆雪，解林奇，劉媛媛，王安如

(北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100192)

0　引言

唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）主要來(lái)源于人和動(dòng)物的口腔及腸道，是一種具有多種生理功能的重要益生菌。研究表明，唾液乳桿菌能夠影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，幫助建立以有益菌為主體的腸道微生物菌群[1]；對(duì)先天性免疫防御系統(tǒng)及免疫機(jī)能具有調(diào)節(jié)作用，提高小腸局部黏膜免疫水平[2-4]；還可產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫，分泌多種細(xì)菌素[5-8]，防止單細(xì)胞增生李斯特菌、幽門(mén)螺旋桿菌等致病菌的感染[9-12]。唾液乳桿菌Ls04能夠在胃腸道模擬環(huán)境中保持高存活率，對(duì)腸道致病菌具有良好的體外抑制作用，具有潛在的益生性能[13]。本文對(duì)Ls04對(duì)小鼠腸道微生物區(qū)系及腸黏膜分泌型免疫球蛋白A（secretory imm unoglobulin A，SIgA）質(zhì)量濃度的影響及持續(xù)作用效果進(jìn)行研究，以期能夠更加全面的評(píng)估唾液乳桿菌Ls04的益生特性。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　材料

菌株：唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）菌株Ls04由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli K 88（C 83901）、E.coli K 99（C 83709）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明白、雄性、3周齡小鼠100只，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，小鼠每籠5只飼養(yǎng)于普通籠中，籠底墊上碎木屑并每3天更換；控制室內(nèi)溫度20℃～25℃、濕度45%～50%，12 h黑暗，12 h光照；日常用水采用純凈水，滅菌，基礎(chǔ)日糧為SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)小鼠生長(zhǎng)維持期顆粒飼料，自由采食飲水。

培養(yǎng)基及試劑：BBL瓊脂培養(yǎng)基用于雙歧桿菌（Bifidobacterium）計(jì)數(shù)；M RS瓊脂培養(yǎng)基用于乳桿菌（Lactobacillus）計(jì)數(shù)；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Violet red bile glucose，VRBG）用于腸桿菌（Enterobacteriaceae）計(jì)數(shù)；Pfizer瓊脂培養(yǎng)基用于腸球菌（Enterococcus）計(jì)數(shù)；胰月示亞硫酸鹽環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（T ryptose sulfite cycloserine，TSC）用于產(chǎn)氣莢膜梭菌（C lostridium perfringens，C.perfringens）計(jì)數(shù)；營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（N utrient Broth，NB）用于大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）K88、K99培養(yǎng)；小鼠SIgA Elisa（enzym e linked imm unosorbent assay）試劑盒用于小鼠腸黏膜SIgA含量的測(cè)定。

1.2　方法

1.2.1菌株活化及抑菌實(shí)驗(yàn)

將冷凍干燥的唾液乳桿菌Ls04菌粉（實(shí)驗(yàn)室制備，活菌數(shù)為8.4×1010cfu/g）接種于M RS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，經(jīng)傳代培養(yǎng)，以1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后，5 000 r/min離心10 min，取上清液用于抑菌試驗(yàn)；將營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（含1%葡萄糖）高壓高溫滅菌后，冷卻至45℃，按1μL菌液/mL培養(yǎng)基的比例加入過(guò)夜培養(yǎng)的E.coli K 88、K 99菌液，震蕩混勻，倒入無(wú)菌平板，凝固待用。在瓊脂平板等距放置3只牛津杯，每只牛津杯中加入100μL待測(cè)唾液乳桿菌菌液（3個(gè)重復(fù)），37℃培養(yǎng)20 h，卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

小鼠購(gòu)進(jìn)后，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分成4組，每組25只，即Ls高、中、低劑量組及對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組如表1所示。各組灌胃量均為0.2 mL/只，灌胃時(shí)間15 d。

表1　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

2　結(jié)果

1.2.3小鼠大腸黏膜采集及菌群測(cè)定

將灌胃前及灌胃15 d各處理組小鼠，及灌胃結(jié)束后第3，7，14天的Ls中劑量組小鼠斷頸處死，每組5只，解剖后剖開(kāi)大腸，無(wú)菌操作刮取大腸黏膜組織約0.1 g，將其溶于10 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分溶解后進(jìn)行稀釋，選3個(gè)稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行。用于大腸桿菌計(jì)數(shù)的VRBG平板于30℃培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果；用于乳桿菌計(jì)數(shù)的MRS平板以及用于雙歧桿菌計(jì)數(shù)的BBL平板置于厭氧罐中，37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)；腸球菌于Pfizer平板計(jì)數(shù)，35℃厭氧培養(yǎng)48 h；產(chǎn)氣莢膜梭菌用TSC平板分離，涂布完成后倒置于厭氧罐中，36℃培養(yǎng)20 h后計(jì)數(shù)[14]。

1.2.4小鼠小腸黏膜采集及SIgA測(cè)定

無(wú)菌取上述處理組小鼠小腸部分2.5 cm，去除腸道內(nèi)殘?jiān)?，刮取小腸黏膜表面，加入無(wú)菌pH=7.2濃度為0.01m ol/L的PBS緩沖溶液200μL，充分震蕩混勻，于40℃，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心15 min，收集上清液，-80℃凍存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫方法（ELISA）中的雙抗體夾心法測(cè)定樣品中SIgA水平[15]，按SIgA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)合Ducan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.1　唾液乳桿菌Ls04抑菌特性

E.coli K 88、K 99被認(rèn)為是引起腹瀉的主要致病菌。由表2可以看出，唾液乳桿菌Ls04的菌液在E.coli K 88和K 99平板上均表現(xiàn)出清晰的透明抑菌圈，表明該菌對(duì)E.coli K 88和K99具有顯著的抑菌特性。

表2　唾液乳桿菌菌液抑菌圈直徑（n=3）

2.2　不同劑量的唾液乳桿菌Ls04對(duì)小鼠腸道菌群的影響

灌胃前后各處理組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)如表3所示。由表3可以看出，對(duì)照組小鼠經(jīng)15 d灌胃后，腸球菌數(shù)量顯著升高（P＜0.05），乳桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量相較于灌胃前均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Ls低、中、高劑量組小鼠腸道中乳酸菌數(shù)量隨灌胃劑量的增加而顯著升高（P＜0.05）。雙歧桿菌數(shù)量同樣顯著升高，Ls低、中、高劑量組之間差異不顯著，但Ls中劑量組中雙歧桿菌數(shù)量最高，達(dá)4.2×107cfu/g左右。灌胃唾液乳桿菌Ls04后，腸球菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌均被顯著抑制。Ls低劑量組小鼠腸道中腸桿菌、腸球菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），Ls04中劑量、高劑量的添加則顯著降低了小鼠腸道中上述各菌數(shù)量（P＜0.05）。Ls中劑量組中腸桿菌、腸球菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量分別約為7.8×104，1.7×107g-1及3.3×104g-1，顯著低于對(duì)照組而與Ls高劑量組無(wú)顯著差異。由此可見(jiàn)，Ls04中劑量的添加即可有效增加小鼠腸道中有益菌數(shù)量，并最大程度抑制腸桿菌等腸道致病菌。

2.3　不同劑量的唾液乳桿菌對(duì)小鼠腸道黏膜SIgA質(zhì)量濃度的影響

灌胃唾液乳桿菌Ls04對(duì)小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度同樣具有顯著影響（P＜0.05）。如圖1所示，Ls低劑量組小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度約為15.8μg/mL，與對(duì)照組無(wú)顯著差異。Ls中、高劑量組與對(duì)照組相比，小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度均顯著升高，并且Ls中劑量組小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度最高，約為19.1μg/mL。

圖1 灌胃唾液乳桿菌Ls04對(duì)小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度的影響（n=5）

圖1中，柱狀圖上所標(biāo)字母相異表示差異顯著（P＜0.05），所標(biāo)字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

2.4　唾液乳桿菌的定植對(duì)小鼠腸道菌群的影響

為進(jìn)一步研究唾液乳桿菌Ls04的定植對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的持續(xù)作用，在Ls中劑量組小鼠灌胃結(jié)束后14 d內(nèi)，研究其腸道菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。如表4所示，灌胃結(jié)束后，Ls中劑量組小鼠腸道中乳桿菌及雙歧桿菌數(shù)量分別約為2.4×108g-1和4.2×107g-1，結(jié)束后3 d，腸道中乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量有所降低，隨后保持相對(duì)穩(wěn)定。至灌胃結(jié)束后14 d，小鼠腸道中乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量分別為1.3×108g-1和3.0×107g-1，仍顯著高于灌胃前水平（P＜0.05）。灌胃中劑量Ls04使小鼠腸道中腸桿菌數(shù)量顯著降低，至灌胃結(jié)束后14 d，腸桿菌數(shù)量雖顯著升高至約2.1×105g-1，相較于灌胃前仍被顯著抑制（P＜0.05）。產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量在灌胃結(jié)束后顯著升高，至14 d其數(shù)量基本恢復(fù)至灌胃前數(shù)量水平（P＜0.05）。而小鼠腸道中腸球菌數(shù)量在灌胃結(jié)束后并無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

2.5　唾液乳桿菌的定植對(duì)小鼠腸道黏膜SIgA質(zhì)量濃度的影響

為研究唾液乳桿菌Ls04的定植對(duì)小鼠腸黏膜SI-gA質(zhì)量濃度的影響，本研究對(duì)Ls中劑量組小鼠在灌胃前及灌胃結(jié)束后14 d內(nèi)小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了測(cè)定。如圖2所示，灌胃中劑量Ls04后，小鼠小腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度顯著升高。在灌胃結(jié)束7d內(nèi)，小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度顯著降低，隨后保持相對(duì)穩(wěn)定，至灌胃結(jié)束后14 d，腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度約為16.1μg/mL，顯著高于灌胃前水平（P＜0.05）。

圖2中，柱狀圖上所標(biāo)字母相異表示差異顯著（P＜0.05），所標(biāo)字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

圖2　Ls04中劑量組小鼠灌胃前及灌胃后小腸黏膜SIgA的動(dòng)態(tài)變化（n=5）

表3　灌胃唾液乳桿菌對(duì)各組小鼠腸道菌群的影響（n=5） g-1

表4　灌胃結(jié)束后唾液乳桿菌Ls04中劑量組小鼠大腸黏膜處微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)變化（n=5） g-1

3　結(jié)果與討論

唾液乳桿菌Ls04滿足潛在益生菌的篩選標(biāo)準(zhǔn)，且對(duì)E.coli K 88、E.coli K99具有顯著的抑菌特性，這與之前報(bào)道相一致[16-18]。除大腸桿菌外，唾液乳桿菌由于其高效產(chǎn)酸性能及其所產(chǎn)細(xì)菌素的廣譜抑菌特性[6,9]，對(duì)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌均具有顯著的體外抑制作用[19]。

微生物菌劑進(jìn)入到機(jī)體腸道后，需要在腸黏膜表面黏附定植、形成生物屏障并分泌抑菌物質(zhì)，才能有效抑制病原菌，發(fā)揮平衡腸道微生物區(qū)系的益生作用。Tannock等[20]曾報(bào)道，唾液乳桿菌是為數(shù)不多的能夠在宿主腸道內(nèi)有效定植甚至在腸道乳酸菌中占數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的菌種。本文結(jié)果顯示，Ls中劑量組小鼠在灌胃結(jié)束14 d乳酸菌數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定且高于灌胃前水平，這一點(diǎn)間接說(shuō)明了唾液乳桿菌Ls04的腸道定植力。本文結(jié)果同樣顯示，灌胃Ls04能夠顯著提高小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量，而這一結(jié)果在仔豬動(dòng)物試驗(yàn)上得到了證實(shí)：飼喂仔豬唾液乳桿菌B1后，B1能夠有效地定植于仔豬腸道內(nèi)，并且增加哺乳前期仔豬糞便和十二指腸局部黏膜雙歧桿菌的相對(duì)豐富度[21]。

益生菌的作用機(jī)制不僅包括平衡胃腸道微生物環(huán)境，還能對(duì)腸道免疫系統(tǒng)進(jìn)行有效的刺激和調(diào)節(jié)[22-23]。SIgA是機(jī)體腸黏膜免疫系統(tǒng)重要的抗體之一，由SIgA參與的體液免疫是防御病原菌在腸黏膜定植的重要防線。因此，本文對(duì)Ls04對(duì)小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度的影響及持續(xù)作用效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，唾液乳桿菌Ls04能夠在腸道內(nèi)有效定植并促進(jìn)腸黏膜SIgA的分泌。張錦華（2011）曾報(bào)道了唾液乳桿菌B1對(duì)新生仔豬免疫性能的影響，結(jié)果表明，飼喂唾液乳桿菌B1后，仔豬小腸、特別是十二指腸處IgA分泌細(xì)胞數(shù)量相較于對(duì)照組顯著升高，差異極顯著[21]，這與本文結(jié)果基本一致。此外，有報(bào)道稱腸道內(nèi)的一些共生菌同樣能夠誘導(dǎo)SIgA的分泌[24]。Moreau和Baforiau-Routhiau研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌、特別是在嬰兒腸道中的雙歧桿菌，與促進(jìn)SIgA的合成分泌以及提高抗感染病原菌的能力密切相關(guān)[25]。

本文結(jié)果提示，唾液乳桿菌Ls04在停止服用后仍能夠有效抑制小鼠腸道致病菌，增殖有益菌；并且能夠持續(xù)有效地提高小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度，刺激機(jī)體免疫反應(yīng)。因此將唾液乳桿菌Ls04應(yīng)用到益生菌產(chǎn)品中去，可持續(xù)平衡腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]TINRAT S，SARAYA S，CHOMNAWANG M T.Isolation and characterization of lactobacillussalivariusMTC1026 as a potential probiotic[J].Journal of General and Applied Microbiology，2011，57（6）：365-678.

[2]LANGA S，JUAN M R，RUTH IC，etal.Characterization ofLac to bacillus salivariusCECT 5713，a strain isolated from human milk：fromgenotype to phenotype[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2012，94（5）：1279-1287.

[3]DENG J，LIY F，ZHANG JH，et al.Co-administration of Bacillus subtil is RJGP16 and Lactobacillus salivarius B1 strongly enhances the intestinal mucosal immunity of piglets[J].Research in Veterinary Science，2013，94（1），62-68

[4]ZHANG J，DENG J，WANG Z，et al.Modulatory effects ofLactobacillussalivarius on intestinal mucosal immunity of piglets[J].Current Microbiology，2011，62，1623-1631.

[5]BARRETT E，HAYESM，O’CONNOR P，et al.Salivaricin P,one of a family of two-component antilisterial bacteriocins produced by intestinal isolates ofLactobacillus salivarius[J].Applied and Environmental Microbiology，2007，73：3719-3723.

[6]MESSAOUDIS，KERGOURLAY G，DALGALARRONDO M，et al.Purification and characterization of a new bacteriocin active against Campylobacter produced by Lactobacillus salivarius SMXD51[J].Food Microbiology，2012，（1），129-134.

[7]RIBOULET-BISSON E，STURMEM H J，JEFFERY IB.Effect of Lactobacillussalivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig IntestinalM icrobiota[J].PlosOne，2012，7（2），e31113.

[8]O’SHEA E F，O’CONNOR M，PAUL D C，et al.Production of multiple bacteriocins from a single locus by gastrointestinal strains ofLactobacillus salivarius[J].Journal of Bacteriology，2011，193（24）：6973-6982.

[9]CORR SC，LIY，RIEDEL C U，et al.Bacteriocin production as a mechanism for the anti infective activity ofLac to bacillus salivariusUCC118[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104，7617-7621.

[10]MESSAOUDIS，KERGOURLAY G，ROSSERO A，et al.Identification of lactobacilli residing in chicken cecaw ith antagonism against Campylobacter[J].International Microbiology，2011，14：103-110.

[11]AUDISIO M C，APELLA M C.Bacteriocin-like substance produced byLactobacillus salivarius subsp.salivariusCRL1384 with anti-Listeria and anti-Salmonella effects[J].Research Journal of Microbiology，2010，5（7），667-675.

[12]RYAN K A，DALY P，LIY，etal.Strain-specific inhibition ofHelicobacter pylori by Lactobacillus salivarius and other lactobacilli[J].Journal of antimicrobial chemotherapy，2008，61（4）：831-834.

[13]郭本恒.益生菌[M].北京：化工工業(yè)出版社，2004.

[14]徐致遠(yuǎn)，郭本恒，王蔭榆，等.植物乳桿菌ST-Ⅲ對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2006，34（2）：10-12.

[15]周晶，周穎，曹鳳波，等.乳酸桿菌對(duì)感染大腸桿菌小鼠腸黏膜免疫的影響[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2015，43（2）：12-15.

[16]NOURIM，RAHBARIZADEH F，AHNADVAND D，et al.Inhibitory effects ofLac to bacillus salivarius and Lac to bacillus crispatusisolated from chicken gastrointestinal tract onSalmonell aenteritidis andEscherichiacoli growth[J].Iranian Journal of Biotechnology，2010，8（1），32-37.

[17]R IBOULET-BISSON E，STURMEM H，JEFFERY IB.Effect ofLactobacillussalivariusbacteriocin Abp118 on the mouse and pig intestinal microbiota[J].Plos One，2012，2（7），1-12.

[18]MESSAOUDIS，MADIA，PREVOUST H，et al.In vitro evaluation of the probiotic potential ofLacto bacillus salivariusSMXD 51[J].Anaerobe，2012，18：584-589.

[19]齊炳理，李艷杰，陳世賢，等.唾液乳桿菌的生長(zhǎng)特性及抑菌作用[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2015，38（3）：1-4.

[20]TANNOCK GW，MUNRO K，HARMESEN H J，et al.Analysis of the fecal micr of lora of human subjects consuming aprobiotic product containingLactobacillus rhamnosusDR20.Applied and Environmental Microbiology[J].2000，66（6）：2578-2588.

[21]張錦華.豬源乳酸桿菌的篩選及及其對(duì)仔豬腸道黏膜免疫影響的研究[D].南京，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[22]PEREZ-CAN of J，DONG H，YAQOOB P.In vitro immunomodulatory activity ofLactobacillus fer mentumCECT5716 and Lacto bacillus salivarius CECT5713:two probiotic strains isolated from human breast milk[J].Immunobiology，2010，215，996-1004.

[23]SIERRA S，LARA-VILLOSLADA F，SEMPERE L，et al.Intestinal and immunological effects of daily oral administration ofLactobacillus salivariusCECT5713 to healthy adults[J].Anaerobe，2010，16：195-200.

[24]MACPHERSON A J，UHR T.Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria[J].Science，2004，303（5664）：1662-1665.

[25]MOREAU M C，BAFOR IAU-ROUTH IAU V.Influence of resident intestinal microflora on development and functions of the in terstinal-associated lymphoid tissue[J].Springer Netherlands，2000，13（2）：69-114.