三種乳源生物活性肽的二肽基肽酶-IV抑制活性研究

陳靜 ，李婉如，李阜爍 ，汪超，范夢珠 ，占東升，李錫安，張少輝 ，2

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江溫州325800；3.浙江熊貓乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，浙江溫州325800）

0　引言

乳蛋白是通過降解成多肽而發(fā)揮降血糖作用，因此乳源多肽具有潛在的治療二型糖尿病研究價值[1-3]。二型糖尿病是胰島素相對缺乏引起的慢性代謝疾病[4]。腸促胰島素能夠促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰高血糖素釋放，刺激β細(xì)胞增殖，并維持體內(nèi)葡萄糖平衡[5]。但是腸促胰島素中的胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素肽（glucose-dependent insulinotropic peptide,GIP）是內(nèi)源二肽基肽酶-IV（DPP-IV;EC 3.4.14.5;CD 26）的底物[6]。因此，抑制DPP-IV活性可以保護(hù)腸促胰島素，刺激胰島素分泌，從而治療二型糖尿病。

本文建立了體外DPP-IV篩選模型，研究了三種乳源多肽的DPP-IV抑制活性及其半抑制濃度（IC 50），并對DPP-IV抑制肽的抑制類型進(jìn)行研究。同時探討了復(fù)合肽的抑制作用，為乳源多肽的降血糖功能食品開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1　實驗

1.1　材料與試劑

人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞）；合成肽LPLP、QEPV、DELQ和IPI（純度＞95%；對硝基苯胺（4-Nitroaniline）；甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺-對甲苯磺酸鹽（Gly-Pro-p-nitroanilidep-to luenesulfonate salt）。

1.2　儀器與設(shè)備

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱；超聲細(xì)胞破碎儀；超凈工作臺；酶標(biāo)儀；高速冷凍離心機(jī)；倒置顯微鏡；電子天平；移液槍。

1.3　方法

1.3.1Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)和DPP-IV提取

將Caco-2細(xì)胞用含10%、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺的DM EN高糖培養(yǎng)基配制成1.5×105個細(xì)胞/mL濃度的細(xì)胞懸浮液，并將細(xì)胞懸浮液以1mL/孔接種于6孔板中。將接種好細(xì)胞的6孔板于37℃，5%二氧化碳含量和90%濕度條件下的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次。于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板面積90%左右，每天換液，再繼續(xù)培養(yǎng)15 d。培養(yǎng)結(jié)束后，用移液槍小心吸出培養(yǎng)液，并用PBS溶液清洗細(xì)胞層2～3次。用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞層，將細(xì)胞收集于滅過菌的離心管中，并用pH值為8.3的T ris-HC l溶液清洗兩次，將清洗液一并收集于裝有細(xì)胞的離心管中。

將收集的細(xì)胞用超聲破碎儀于冰浴下進(jìn)行破碎，破碎條件為超聲時間3 s，間歇時間6 s，超聲90次，超聲功率為250 kW。將超聲破碎液于4℃、10 000 g條件下離心10 min。離心后取上清液即DPP-IV提取液，待用。

DPP-IV滅活處理：取細(xì)胞破碎液于90℃水浴、20 min滅活處理。滅活后，將細(xì)胞破碎液于4℃、10 000 g條件下離心10 min，取上清備用。

1.3.2DPP-IV酶活力測定

1個酶活力單位（1U）定義為在37℃下，pH值為8.3時，底物GLy-Pro-pNA濃度為500μm ol/L，1 min內(nèi)能產(chǎn)生濃度1μm o l/L對硝基苯胺（pNA）的DPP-IV用量。

在96孔板各孔中分別加入濃度梯度為0，0.08，0.16，0.24，0.32 mm ol/L和0.40 mm ol/L的pNA溶液，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。37℃孵育30 min后于405 nm處測定吸光度（OD405nm），然后以pNA濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D405nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

96孔板各孔中分別加入 10，20，30，40μL和50μL DPP-IV提取液，每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔，再向各孔加入50μL濃度為500μm o l/L的GLy-Pro-pNA溶液，并用pH值為8.3的T ris-HC l溶液補(bǔ)充各孔溶液體積至125L（空白對照用Tris-HC l溶液代替DPP-IV提取液）。37℃孵育30 min后于405 nm處測定吸光度（OD405nm），并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活力。

1.3.3單一生物活性肽DPP-IV抑制率測定

向96孔板各孔中加入50μL DPP-IV提取液，再分別加入25μL質(zhì)量濃度為0.0625，3.91，7.81，15.63，31.25，46.88μg/mL和62.50μg/mL的IPI溶液，每個質(zhì)量濃度設(shè)置4個復(fù)孔，再加入50 L濃度為500μm o l/L的GLy-Pro-pNA溶液（空白對照用pH值為8.3的T ris-HC l溶液代替IPI溶液；陰性對照組加入滅活DPP-IV提取液），37℃孵育30 min后于405 nm處測定吸光度（OD405nm）。根據(jù)以下公式計算抑制率，即抑制率=[(陰性對照組OD405nm-空白對照組OD405nm)-(抑制劑OD405nm-抑制劑空白對照組OD405nm)]/(陰性對照組OD405nm-空白對照組OD405nm)×100%。

向96孔板各孔加入50μL DPP-IV提取液，再分別加入25 L質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.5mg/mL和6.25mg/mL的LPLP溶液、QEPV溶液和DELQ溶液，每個質(zhì)量濃度設(shè)置4個復(fù)孔，最后加入50μL濃度為500μm o l/L的GLy-Pro-pNA溶液（空白對照用pH值為8.3的T ris-HC l溶液代替多肽溶液；陰性對照組加入滅活DPP-IV提取液）。37℃孵育30 min后于405 nm處測定吸光度（OD405nm），按照上述公式計算抑制率。

1.3.4單一生物活性肽的DPP-IV抑制類型的測定

用pH 8.3的T ris-HC l溶液將GLy-Pro-pNA配制成濃度為25，50，100，250，500μm ol/L和1 000μm ol/L溶液，將多肽LPLP和QEPV分別配制成質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.5 mg/mL和6.25 mg/mL溶液，將所有溶液冰浴30 min。

向96孔板各孔中加入50 L DPP-IV提取液，再分別加入50 L各個濃度的底物GLy-Pro-pNA，每個底物濃度設(shè)置4個復(fù)孔，最后每孔加入50μL一種質(zhì)量濃度多肽。對所配置的不同質(zhì)量濃度的多肽重復(fù)上述加樣過程。加樣完成后，立即于405 nm測定OD值，設(shè)置孵育溫度為37℃，前30min內(nèi)，每5min測定一次OD值。根據(jù)所得OD值計算酶反應(yīng)產(chǎn)物pNA濃度c，并以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物濃度為橫坐標(biāo)作圖，用積分法計算反應(yīng)初速度(V=d[c]/dt|t=0)。

對不同底物濃度時反應(yīng)的初始速度[V]和各對應(yīng)的初始底物濃度[S]作倒數(shù)，并以l/[V]為縱坐標(biāo)，以1/[S]為橫坐標(biāo)作回歸曲線，并擬合回歸方程，根據(jù)Line weaver-Burk雙倒數(shù)作圖法公式l/[V]=K’m/V’max×1/[S]+1/Vmax即可計算得到K’m和 Vmax值。判斷各個多肽的相應(yīng)的抑制類型。

1.3.5復(fù)合生物活性肽的DPP-IV抑制活性的評價

配制兩種肽混合溶液（LPLP∶QEPV=LPLP IC50∶QEPV IC50=0.8414∶14.4524），其中LPLP的終質(zhì)量濃度分別為0.0263，0.0526，0.1052，0.2104，0.4207mg/mL和0.8414mg/mL，按混合比例加入QEPV。

向96孔板各孔加入50μL DPP-IV提取液，再分別加入25μL復(fù)合多肽溶液，每個質(zhì)量濃度肽溶液設(shè)置4個復(fù)孔，最后加入 50μL的500μm ol/LGLy-Pro-pNA溶液（空白對照用Tris-HC l溶液代替多肽溶液；陰性對照組加入滅活DPP-IV提取液）。37℃孵育30min后于405 nm處測定OD值，計算兩種多肽聯(lián)合抑制率。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式來表達(dá)，并用O riginPro9.2軟件對多肽的DPP-IV抑制率進(jìn)行回歸分析。兩種多肽的復(fù)合抑制作用采用Calcusyn2.0軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　酶活力的測定結(jié)果

GLy-Pro-pNA在踐行條件下被DPP-IV水解，產(chǎn)生在405 nm處具有強(qiáng)吸收峰的反應(yīng)產(chǎn)物pNA[7]。DPP-IV提取物的體積用量與DPP-IV酶活力呈線性相關(guān)，R2=0.9968。如圖1所示，細(xì)胞破碎液的用量的改變可以引起酶活力的改變，二者間的改變呈線性相關(guān)?？梢愿鶕?jù)實驗結(jié)果，用Tris-HCl將DPP-IV提取液稀釋為0.0015 U/mL。

圖1　細(xì)胞破碎液體積-酶活力相關(guān)性曲線

2.2　模型驗證

IPI是DPP-IV的一種抑制劑，本課題用IPI來作為驗證DPP-IV抑制劑篩選模型的陽性對照藥物[8]。以IPI濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，作回歸曲線，并擬合得到回歸方程。如圖2顯示，DPP-IV抑制率隨著IPI濃度的增加而增加。根據(jù)回歸方程計算IPI IC50值為（31.51±1.51）μg/mL，與文獻(xiàn)報道[9]的一致。因此，該模型可以應(yīng)用于DPP抑制劑的篩選以及DPP-IV抑制劑動力學(xué)研究。

圖2　IPI對DPP-IV的抑制活性劑量效應(yīng)曲線

2.3　LPLP，QEPV和DELQ抑制活性的測定

根據(jù)所建立模型的方法，測定各個質(zhì)量濃度多肽所對應(yīng)的抑制率，以多肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，作回歸曲線，并擬合得到回歸方程。如圖3，根據(jù)回歸方程計算LPLP和QEPV的IC50值分別為（0.84±0.06）mg/mL和（14.45±1.07）mg/mL。如圖3，根據(jù)回歸方程計算得DELQ的IC50值大于100 mg/mL，即DELQ對DPP-IV抑制作用不明顯。有研究結(jié)果表明多數(shù)多肽鏈氮末端倒數(shù)第二位含有脯氨酸的多肽可以作為DPP-IV酶的底物[10]。多肽鏈碳末端倒數(shù)第一位含有脯氨酸的二肽是DPP-IV抑制劑，實驗證明具有同樣構(gòu)造的部分三肽和四肽也是DPP-IV抑制劑[11]。本實驗結(jié)果與文獻(xiàn)一致，肽鏈氮末端第二位或者氮末端第一位含有脯氨酸的LPLP和QEPV對DPP-IV具有抑制作用。

圖3　三種生物活性肽對DPP-IV抑制作用的劑量效應(yīng)曲線

表1　生物活性肽對DPP-IV抑制活性的IC50

2.4　LPLP和QEPV抑制類型

動力學(xué)層面，酶抑制類型主要可以分成競爭性抑制、非競爭性抑制、無競爭抑制和混合抑制四種類型[12]。根據(jù)實驗所得不同濃度的底物[s]與所對應(yīng)的加了不同質(zhì)量濃度多肽的DPP-IV水解底物速度[v]，采用Linew eaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，得到如圖6和圖7所示LPLP和QEPV對DPP-IV抑制作用的動力學(xué)曲線。結(jié)合米氏方程y=Km/Vmax×x+1/Vmax[13]

和Linew eaver-Burk雙倒數(shù)圖計算得到如表2所示的米氏常數(shù)（Km）和Vmax。Vmax是底物濃度達(dá)到最大時的反應(yīng)速率，而Km是與底物結(jié)合酶的親和力成反比的值[13]。無論反應(yīng)中是否有多肽存在Km的變化沒有顯著性差異（P≥0.05），而Vmax值隨著多肽質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)顯著減小。Vmax隨著抑制劑濃度的增加顯著減小而K m沒有隨著濃度的變化呈現(xiàn)顯著的變化，則該抑制劑在反應(yīng)中的抑制類型是非競爭性抑制[14]，所以根據(jù)實驗結(jié)果表明LPLP和QEPV對DPP-IV的抑制類型是非競爭性抑制作用。實驗結(jié)果說明LPLP和QEPV并非是通過與DPP-IV與底物作用的活性中心結(jié)合，而是在DPP-IV活性部位以外的部位與DPP-IV結(jié)合使得酶-底物-抑制劑復(fù)合物不能釋放出產(chǎn)物，從而達(dá)到抑制DPP-IV活性的目的。

2.5　復(fù)合生物活性肽的DPP-IV抑制活性的評價

采用周氏中效原理[15]并用Calcusyn2.0軟件對單一四肽LPLP、QEPV和復(fù)合多肽的DPP-IV抑制效果進(jìn)行分析。如圖7所示，對DPP-IV的活性抑制作用受到LPLP和QEPV劑量的影響，且據(jù)圖可以計算出LPLP和QEPV混合肽對DPP-IV抑制活性的IC50值。觀察到在相同劑量下，單一多肽和復(fù)合的抑制效率從大到小依次為混合肽（LPLP∶QEPV=LPLP IC50:QEPV IC50）＞LPLP＞QEPV。用等效應(yīng)法分析兩種酶

圖5　LPLP抑制DPP-IV的雙倒數(shù)圖（Line weaver-Burk plots）

圖6　QEPV抑制DPP-IV的雙倒數(shù)圖（Lineweaver-Burk plots）

抑制劑的聯(lián)合作用，將兩種酶抑制的ED 50、ED 75和ED 90坐標(biāo)軸的橫縱坐標(biāo)上的端點(diǎn)，將對應(yīng)的ED 50、ED 75或ED 90兩點(diǎn)間以直線相連，再將聯(lián)用后的酶抑制劑的ED 50、ED 75和ED 90作為橫縱坐標(biāo)描點(diǎn)，若所描的聯(lián)合作用的點(diǎn)位于直線下方則為兩種酶抑制劑間為協(xié)同作用；若位于直線上則兩種酶抑制劑間為加和作用；若在直線上方則二者為拮抗作用[16]。圖8所示，ED 50、ED 75和ED 90處兩種多肽復(fù)合作用的點(diǎn)均在LPLP和QEPV單獨(dú)作用的等效直線下方，說明LPLP和QEPV聯(lián)合作用于DPP-IV是協(xié)同作用。藥物聯(lián)合指數(shù)（CI，Combination Index）的大小可以判定藥物聯(lián)合的相互作用，C I＜1表示兩種藥物之間的相互作用是協(xié)同作用；C I=1,，表示兩種藥物之間的相互作用是加和作用；CI＞1，表示兩種藥物之間的相互作用是拮抗作用[17]。表3中，兩種多肽聯(lián)合作用在ED 50、ED 75和ED 90處的 C I分別為 0.68024、0.74039和0.81724，均小于1，說明LPLP和QEPV作為DPP-IV競爭性抑制劑協(xié)同作用于DPP-IV并非簡單的相加抑制作用，而是協(xié)同作用。因此，兩種多肽的協(xié)同作用的效果優(yōu)于單一多肽的作用效果。

圖7　單一肽（LPLP、QEPV）及混合肽對DPP-IV抑制作用的劑量效應(yīng)曲線

圖8　LPLP和QEPV相互作用的等效曲線

3　結(jié)論

目前關(guān)于DDP-IV抑制劑的體外篩選主要采用純化的DPP-IV進(jìn)行，而本實驗直接采用的細(xì)胞破碎液DPP-IV粗提物能夠模擬細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境，并驗證了陽性對照物IPI對DPP-IV抑制作用，成功地建立了DPP-IV抑制劑體外篩選模型。然后采用建立的DPP-IV抑制劑篩選模型測定了三種多肽LPLP、QEPV和DELQ的DPP-IV抑制活性，并對實驗結(jié)果

表2　LPLP和QEPV抑制DPP-IV酶動力學(xué)參數(shù)K m和 V max

表3　單一肽和多肽復(fù)合的劑量效應(yīng)關(guān)系

中具有DPP-IV抑制活性的LPLP和QEPV的抑制動力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LPLP和QEPV是通過與DPP-IV活性部位結(jié)合達(dá)到抑制其活性的作用。而這兩種多肽的肽鏈上均含脯氨酸，由此推斷，含脯氨酸的多肽的構(gòu)型與DPP-IV活性抑制相關(guān)。采用周氏中效原理對兩種多肽聯(lián)用對DPP-IV抑制活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)合多肽的作用效果高于單一活性肽對DPP-IV活性的抑制作用，從而達(dá)到有效抑制DPP-IV活性的目的。本文為開發(fā)生物活性肽在DPP-IV抑制活性和降血糖方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。然而，生物活性肽進(jìn)入體內(nèi)后的環(huán)境更為復(fù)雜，所以需要進(jìn)一步開展動物實驗研究生物活性肽的體內(nèi)DPP-IV活性抑制作用和降血糖效果。

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