美洲大蠊乙醇提取物中原兒茶酸超高效液相色譜定量分析方法的建立

郭昕， 鞏榮艷， 朱娟娟， 曾成娟， 沈詠梅， 岳碧松， 李靜*

1. 四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065；2.四川省藥用動物工程技術(shù)研究中心，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責任公司，成都610031)

美洲大蠊Periplanetaamericana隸屬于昆蟲綱Insecta蜚蠊目Blattaria大蠊屬Periplaneta，是重要的藥用昆蟲，臨床上對創(chuàng)面的修復及愈合具有明顯的促進作用，同時還具有消炎抗菌、保肝抗腫瘤、增強機體免疫力等功能(胡艷芬等，2008；史未名，2012；吳紅梅等，2013；湯雁利等，2014；陳啟亮等，2015；張漢超等，2017)。原兒茶酸(protocatechuic acid，PCA)化學名稱為3，4-二羥基苯甲酸，是一種天然的酚酸類物質(zhì)。研究顯示，這種廣泛存在的化合物在抗癌、抗氧化、神經(jīng)保護、修復缺血損傷，以及治療阿爾茲海默病、過敏性哮喘、帕金森癥、乙型肝炎等方面都發(fā)揮了重要作用。PCA具有多樣的生物活性，如提高心肌耐氧能力、減慢心率、抗高血糖以及抗腫瘤，此外，還具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制細胞凋亡、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、祛痰等功能，臨床上常用于治療慢性氣管炎，同時PCA能夠抑制體外的化學致癌物質(zhì)，達到促凋亡和抗增殖的效果，具有潛在的化學防護及抗乙肝病毒價值(Anetal.，2006；魏苗苗，2013；黃非，2017；張曉燕等，2017)。研究表明，美洲大蠊除了含有大量的脂肪酸、多糖、氨基酸、多元醇(楊勇勛，2013；滿紅霞等，2014；周芹芹等，2015)，還含有水楊酸、PCA及核苷酸類成分。學者們已通過高效液相色譜法建立了定量分析美洲大蠊提取物中尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷含量的方法(楊勇勛，2013；周蘇，2013；黃博等，2014；蔣文賢等，2015；李旸等，2015；溫慧敏等，2015)。但迄今為止，關(guān)于美洲大蠊中其他藥理活性成分的定量分析仍缺乏相關(guān)報道。

美洲大蠊乙醇提取物是康復新液上市藥品的基礎(chǔ)成分，呂娜等(2017)通過萃取、制備型液相和波譜法發(fā)現(xiàn)美洲大蠊乙醇提取物含有PCA，但其在美洲大蠊乙醇提取物中的含量分析尚未見報道。

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比，具有分離度更高、分析速度更快、檢測器靈敏度更高的特點。UPLC色譜柱采用粒徑小于2 μm的填料，顯著增加了柱的效能。與傳統(tǒng)的C18色譜柱相比，T3色譜柱能保證與100%水相流動相兼容，對不同極性的化合物均有良好的保留，在分析過程中適用范圍更廣。本文擬通過外標法在UPLC上運用T3色譜柱建立定量分析美洲大蠊乙醇提取物中PCA的方法，同時測定PCA的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器材料

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀，配備ACQUITY Arc系統(tǒng)及PDA檢測器；ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，美國Waters公司。

美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液(批號：B170205)由四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責任公司提供；PCA(批號：223812，J & K Chemical公司)，質(zhì)量分數(shù)≥98%。

1.2 樣品制備

美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液經(jīng)13 000 r·min-1高速離心1 min，取上清液過膜后，每個樣品瓶分裝1.5 mL，分裝6個樣品瓶備用，作為供試品。

稱取0.016 g PCA溶于100 mL甲醇配成濃度為160 μg·mL-1的PCA對照品溶液，再加甲醇等比例依次稀釋到80 μg·mL-1、40 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1，每個濃度保留10 mL，置于4 ℃冰箱備用。

1.3 系統(tǒng)適應性實驗

美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液、濃度為160 μg·mL-1的PCA對照品溶液各1 mL，13 000 r·min-1高速離心1 min，取上清液過膜后備用。精確稱取1 mg PCA加入到3 mL美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中，充分溶解后離心過膜，作為加樣對照組。上述樣品均按照本實驗建立的色譜條件進樣分析。

1.4 方法學實驗

1.4.1線性關(guān)系考察在本實驗建立的色譜條件下，按照濃度由低到高的順序?qū)?個濃度PCA對照品溶液依次進樣分析。分別記錄各個濃度PCA對照品溶液的相對峰面積。然后以濃度為橫坐標、相對峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行線性分析(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

1.4.2精密度實驗取1 mL 160 μg·mL-1的PCA，離心過膜后在本實驗建立的色譜條件下連續(xù)進樣6次，以PCA對照品溶液的峰面積計算相對標準偏差(RSD)(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

1.4.3穩(wěn)定性實驗取1份供試品在本實驗建立的色譜條件下每隔2 h進樣1次，共進樣6次。取6組中PCA所對應的峰面積計算RSD，評估樣品的穩(wěn)定性(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

1.4.4重復性實驗取6份供試品在本實驗建立的色譜條件下每份樣品進1針，不間斷分析。取6組中PCA所對應的峰面積計算RSD(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

1.4.5加樣回收實驗取3份10 mL已知含量的美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液按照1∶2、1∶1、2∶1(已知量∶添加量)比例向其中分別添加1.00 mg、0.50 mg、0.30 mg PCA，每種添加濃度進行3次平行實驗，實驗數(shù)據(jù)取平均值；根據(jù)加樣回收率=(測得量-固有含量)/加入量×100%計算(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

2 結(jié)果

2.1 UPLC洗脫條件建立

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm；1.8 μm)，樣品溫度25 ℃，進樣量1 μL，柱溫40 ℃，流速0.5 mL·min-1，檢測波長設置3個，分別是190～450 nm、254 nm、360 nm。流動相選擇緩沖鹽(0.1%甲酸，25 mmol甲酸銨)(流動相A)和100%乙腈(流動相B)，洗脫時間為11 min(劉璇等，2013；馮光維等，2016)。洗脫梯度見表1。

表1 UPLC洗脫梯度程序Table 1 Elution gradient program of UPLC

實驗初期，選擇流動相A(0.1%乙酸)、流動相B(100%乙腈)時，出峰效果不理想，分離度差，有拖尾現(xiàn)象；后加入緩沖鹽，改用流動相A(0.1%甲酸和25 mmol甲酸銨)后，峰型明顯改善，達到了預期的分離效果。

在選擇檢測波長時，190～450 nm為全波長；280 nm是PCA的最大吸收波長；360 nm處的特征吸收峰可以幫助鑒定特征物質(zhì)，因此，選擇在190～450 nm、254 nm、360 nm下同時檢測。為了滿足美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中高極性成分的分析要求，選用T3色譜柱代替常用的C18色譜柱。結(jié)果顯示，T3色譜柱能準確分析原液中的目標成分，適用于本實驗建立的洗脫方法。

為了能夠快速出峰，首先建立9 min的洗脫程序，并未出現(xiàn)PCA的特征峰；當優(yōu)化條件至11 min，在3.3 min處洗脫出分離度較好的單峰，經(jīng)外標法鑒定為PCA，且原液以及PCA對照品的目標峰分離度良好。

2.2 美洲大蠊乙醇提取物的UPLC分析

美洲大蠊乙醇提取物在3.3 min處所出峰與PCA的保留時間一致，且兩者在3.3 min提取的光譜圖均相同(圖1：A，B)；向3 mL美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中加入1 mg PCA對照品后，進樣1 μL分析(圖1：C)，與美洲大蠊乙醇提取物1號峰的出峰時間完全吻合，且峰高及峰面積明顯升高，表明1號峰就是目標成分——PCA。

2.3 方法學實驗結(jié)果

以PCA濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，取5個系列濃度依次進樣分析，繪制標準曲線。結(jié)果表明，在10～160 μg·mL-1內(nèi)，PCA濃度與峰面積呈線性關(guān)系，方程為y=7 188.6x+5 371.7，R2=0.999 9(圖2)。

精密度實驗測得RSD為0.59%，穩(wěn)定性實驗與重復性實驗的RSD分別為0.80%和0.73%，均小于1%，表明儀器的精密度、樣品的穩(wěn)定性以及方法的重復性良好。

加樣回收實驗結(jié)果表明，PCA的平均回收率為98.30%～99.57%，RSD分別為0.40%、0.64%、0.30%，3組回收率均大于98%，RSD均小于1%，符合統(tǒng)計學分析標準，證明樣品及實驗儀器穩(wěn)定，本方法具有良好的回收率(表2)。

圖1 美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液(A)、原兒茶酸(B)和加樣對照組(C)的超高效液相色譜Fig. 1 Ultra performance liquid chromatography of ethanol extract of Periplaneta americana (A)， protocatechuic acid (B) and control group (C)

a. 1號峰的光譜圖， b. 原兒茶酸的光譜圖

a. spectrum of No.1 peak， b. spectrum of protocatechuic acid

圖2 原兒茶酸標準曲線Fig.2 The standard curve of protocatechuic acid

2.4 樣品中PCA的定量分析

根據(jù)標準曲線，求得1 mL美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中含有51.38 μg PCA，即美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中PCA的濃度為51.38 μg·mL-1。

3 討論

周燕園(2014)基于高效液相色譜法比較了乙腈-磷酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-水溶液等流動相系統(tǒng)，最終確定以甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相時，醋五味子配方顆粒中PCA的分離度最好。但傳統(tǒng)的高效液相色譜法分析耗時長、消耗人力物力大。與之相比，UPLC法分析快速、穩(wěn)定性和重復性高，可大大提高分析效率。劉冰等(2015)使用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱建立益智仁的UPLC指紋圖譜，并標定出PCA特征峰。也

表2 原兒茶酸回收率實驗結(jié)果Table 2 The recovery rate of protocatechuic acid

有研究采用Waters H-Class UPLC系統(tǒng)以及ACQUITY UPLC BEH C18柱，以甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水體系建立的測定大血藤及潛陽育陰方中PCA含量的方法也相對成熟(劉曉涵，祁龍凱，2016；孟龑等，2017)。本研究首次采用外標法，通過UPLC分析鑒定了美洲大蠊乙醇提取物中的PCA色譜峰，并針對美洲大蠊乙醇提取物的極性及物質(zhì)組成，在分離度最高、出峰數(shù)量最多的前提下采用T3色譜柱建立了定量分析PCA含量的UPLC法。結(jié)果表明，PCA在UPLC圖譜中的保留時間約3.3 min，本方法重復性好、穩(wěn)定性高，在分析美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中的PCA時針對性強。本研究建立的PCA定量分析方法為今后定量檢測美洲大蠊相關(guān)制劑中該成分提供了重要方法，也為美洲大蠊中藥制劑的質(zhì)量控制研究奠定了基礎(chǔ)。

近年來，隨著對美洲大蠊藥用價值研究的不斷深入，美洲大蠊中多種藥理活性成分不斷被發(fā)現(xiàn)和報道。PCA已被證實具有抗癌、抗氧化、保護神經(jīng)、修復缺血損傷等廣泛的生物活性。本研究基于UPLC法定量檢測了美洲大蠊乙醇提取物中PCA的含量為51.38 μg·mL-1。在UPLC色譜圖上，PCA的色譜峰峰面積比其他色譜峰高，表明該成分可能是美洲大蠊乙醇提取物中重要的活性成分之一，從而為闡明美洲大蠊中的藥用活性成分提供了重要參考。

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