2-甲氧基雌二醇的抗腫瘤作用研究

陳華萬(wàn) 綜述，張健偉，蘆 斌，吳順龍△ 審校

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科 400016;2．陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，重慶 400038;3．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科 400016)

2-ME是雌二醇(17β-estradiol,E2)在體內(nèi)的生理代謝產(chǎn)物。原始的觀點(diǎn)認(rèn)為E2代謝物是不具有活性的。然而最近研究發(fā)現(xiàn)2-ME是E2代謝物中惟一具有抗腫瘤效應(yīng)的代謝物，其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期阻滯、促凋亡與自噬、抑制血管形成等抗腫瘤效應(yīng)，因而得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。2-ME正作為一種很有前景的抗腫瘤藥物進(jìn)行臨床評(píng)估中。

1 2-ME的生物合成及藥理學(xué)特點(diǎn)

雌激素是由膽固醇經(jīng)一系列的生化反應(yīng)形成，然而其直接前體是雄激素，如睪酮。雌激素表達(dá)于靶器官(乳腺、子宮、卵巢、胎盤(pán)等)中，在這些靶器官中E2代謝失活或者產(chǎn)生重要的生化功能。E2由雄烯二酮和睪酮經(jīng)17β膽固醇脫氫酶合成。然后，E2經(jīng)細(xì)胞色素P450羥基化，E環(huán)的2、4、16位羥基化能分別形成2-hydroxyestradiol(2-OHE2)、4-hydroxyestradiol(4-OHE2)和 16-hydroxyestradiol (16-OHE2)。隨后，新合成的鄰苯二酚雌激素被鄰苯二酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyl transferase,COMT)甲基化，分別形成2,4,16甲氧基雌二醇。因細(xì)胞色素P450及COMT廣泛存在于人體內(nèi)各器官中,如肝、腎等,所以諸多組織中均可合成2-ME,但其在不同組織中具體濃度尚不清楚[1]。

在正常的生理?xiàng)l件下，2-ME在血漿中的濃度為10～37 pg/mL。男性、女性及孕婦血漿中2-ME的生理濃度分別為10～35、18～138、216～10 690 pg/mL。大量基礎(chǔ)和臨床的研究都表明2-ME的濃度需要達(dá)到微摩爾水平才能產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，懷孕期間2-ME能達(dá)到血液循環(huán)濃度的最高水平(2～10 ng/mL)。因此2-ME 的生理濃度遠(yuǎn)低于它的效應(yīng)水平[1]。

2-ME存在于血液中，半衰期較短(1～2 d)。人體內(nèi)的2-ME最終隨著尿液排出到體外。體內(nèi) 2-ME 的肝臟清除率高達(dá)712 mL/min,約為人體肝臟血流量的一半,所以首過(guò)代謝作用在2-ME的體內(nèi)分布中起著重要作用。在腫瘤治療過(guò)程中，為達(dá)到良好的治療效果，患者常需大劑量服用2-ME[2]。

2-ME與雌激素受體 α、β 的親和力分別是E2的1/500和1/3 200，且雌激素受體激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)其作用無(wú)影響,表明2-ME并非通過(guò)影響雌激素受體通路起作用，所以2-ME臨床治療并不會(huì)引起雌激素依賴型疾病，如乳腺癌等[3]。

2 2-ME的抗癌功能與機(jī)制

2.1抗增殖與微管紊亂、細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)增殖抑制因子的合成 2-ME在多種腫瘤細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性：乳腺癌(MCF-7、MDAMB-231、MDAMB435、ZR-75、T-47D)，肺癌(A549、H460、HOP64)，卵巢癌(OVCAR-3)，前列腺癌(LNCaP、DU-145)，胰腺癌(PaTu8902、PaTu8988s、PaTu8988t)，胃癌(SC-MI、NUGC-3)，宮頸癌(HeLa、HeLaS3)等[4]。研究表明其抗增殖效應(yīng)的機(jī)制主要與微管紊亂、細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)增殖抑制因子的合成等相關(guān)。

2-ME抗增殖的特點(diǎn)與它對(duì)微管蛋白聚合的影響相關(guān)。微管系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的增殖舉足輕重，是目前很好的抗癌藥的生物靶點(diǎn)，如紫杉醇、長(zhǎng)春花堿和秋水仙堿[4]。最近的結(jié)構(gòu)活性分析表明，抑制微管聚合是2-ME抗增殖的主要分子機(jī)制。有研究表明2-ME在試管內(nèi)高濃度時(shí)可抑制微管聚合而抑制腫瘤生長(zhǎng)，通過(guò)結(jié)合微管蛋白的秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。2-ME是秋水仙堿的一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其KI值為22M[5]。

2-ME的抗增殖活性還與細(xì)胞周期阻滯密切相關(guān)。2-ME在高分化的食管癌細(xì)胞株EC9706中具有抗癌效應(yīng)，發(fā)生G2/M期阻滯，增加細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)和原癌基因c-Myc蛋白水平。在多種雄激素依賴LNCaP和非依賴DU-145和PC-3的前列腺癌細(xì)胞中2-ME能增強(qiáng)S期和G2/M期細(xì)胞的累積[4]。

此外，還有研究表明2-ME可以通過(guò)抑制如一氧化氮(NO)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)前列腺素等促進(jìn)增殖因子的合成,或降低如內(nèi)皮素-1、兒茶酚胺等合成進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

2-ME的抗腫瘤增殖效應(yīng)不依賴于雌激素受體途徑。2-ME對(duì)ER陰性或陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞均具有濃度依賴的抗增殖效應(yīng)，包括ER陰性細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-435，ER陽(yáng)性細(xì)胞MCF-7和T-47D等[6]。另一方面，2-ME在ER陽(yáng)性細(xì)胞株中的效應(yīng)與濃度有關(guān)，低濃度時(shí)促細(xì)胞增殖，高濃度時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。在一個(gè)致癌物誘導(dǎo)的乳腺癌模型中，2-ME低劑量(1 mg/kg)時(shí)有腫瘤刺激效應(yīng)，高劑量(5 mg/kg) 時(shí)具有抑制腫瘤效應(yīng)[7]。所以2-ME的抗腫瘤增殖效應(yīng)與雌激素受體途徑無(wú)直接相關(guān)。

2.2促凋亡與自噬 2-ME可通過(guò)不同的途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常的上皮細(xì)胞、靜止期的內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)作用。在不同細(xì)胞中，2-ME誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制不同。在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，主要是通過(guò)細(xì)胞外源性途徑和內(nèi)源性途徑介導(dǎo)。(1)外源性途徑:2-ME可誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面死亡受體 DR5及Fas表達(dá)增加，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡蛋白酶caspase，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8]。(2)內(nèi)源性途徑:2-ME可通過(guò)激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞色素C的釋放，并與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)、caspase-9前體、ATP/dATP等形成凋亡復(fù)合物體，從而激活caspase，同時(shí)上調(diào)Fas及Bcl-2的表達(dá)[9]。(3)上調(diào) P53 的表達(dá):P53是一種常見(jiàn)的抑癌基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)中均發(fā)揮重要作用。在染色體DNA輕微損傷時(shí)，P53可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)表達(dá)DNA修復(fù)酶對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，以減少突變累計(jì)。當(dāng)損傷嚴(yán)重不能修復(fù)時(shí)，P53將啟動(dòng)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡。研究表明，2-ME可以上調(diào)P53的表達(dá)，通過(guò)獨(dú)立及依賴途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，如2-ME通過(guò)P53獨(dú)立途徑誘導(dǎo)凋亡，然而在非小細(xì)胞肺癌中卻是通過(guò)P53依耐途徑[10]。(4)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(react ive nit rogen species,RNS)：ROS和RNS是引起蛋白質(zhì)氧化損傷的重要因素，可以通過(guò)多種代謝途徑產(chǎn)生，具有較高的反應(yīng)活性，由ROS引起的蛋白質(zhì)氧化性損傷與衰老、腫瘤等的密切發(fā)生相關(guān)。2-ME 產(chǎn)生 ROS 和RNS導(dǎo)致硝基氧化應(yīng)激進(jìn)而減少線粒體膜電位，介導(dǎo)線粒體膜損傷及細(xì)胞色素C釋放,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性作用[11]。(5)抑制端粒酶活性：端粒酶與細(xì)胞的永生和癌癥有密切關(guān)系。2-ME能通過(guò)抑制端粒酶的活性，破壞其穩(wěn)定性，使腫瘤細(xì)胞逐漸凋亡[12]。(6)其他：2-ME誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還可通過(guò)調(diào)節(jié)第五死亡感受器，增強(qiáng)STAT1蛋白的表達(dá)，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶來(lái)實(shí)現(xiàn)[13]。

2-ME除了引起細(xì)胞凋亡，還能激發(fā)細(xì)胞自噬。自噬是一種進(jìn)化保守的代謝途徑，使真核細(xì)胞能夠降解并回收細(xì)胞組分進(jìn)行再利用，自噬過(guò)度則導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡。

用2-ME衍生物——2-甲氧基雌二醇雙氨基磺酸處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7后，發(fā)現(xiàn)溶酶體染色增強(qiáng)，表明自噬增加，然而在非腫瘤細(xì)胞株MCF-12A中卻不會(huì)發(fā)生[14]。2-ME可誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞微管相關(guān)蛋白LC3-1轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)C3-2從而誘導(dǎo)自噬，而該現(xiàn)象在健康人非腫瘤細(xì)胞(如成骨細(xì)胞)中卻未被觀察到[15]。

2-ME的促凋亡活性對(duì)增殖活躍的細(xì)胞具有特異性，特別是腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，2-ME不會(huì)誘導(dǎo)正常的乳腺上皮細(xì)胞和靜止的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。2-ME誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制很多還不清楚，但正由于眾多相反的或潛在的更多機(jī)制使得2-ME作為一種抗癌藥物產(chǎn)生腫瘤耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)性較低。

2.3血管形成抑制 研究表明，2-ME可有效抑制多種腫瘤的血管生成。血管生成的步驟主要包括血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解，產(chǎn)生基底膜縫隙為內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞遷移做好準(zhǔn)備；血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移、增殖，以出芽的方式形成新的毛細(xì)血管，最后血管周?chē)|(zhì)重新包饒血管，新的管腔結(jié)構(gòu)形成。腫瘤血管生成主要與幾個(gè)促血管生成因子密切相關(guān)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PIGE)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)等。在直徑大于1 mm的腫瘤中血管生成是腫瘤增殖環(huán)節(jié)至關(guān)重要的一步。2-ME可通過(guò)多種途徑抑制多種腫瘤的血管生成，主要機(jī)制有：(1)直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；(2)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，有研究表明，2-ME呈劑量依賴性抑制肺動(dòng)脈內(nèi)皮的遷移[16]；(3)抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，2-ME可作用于神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞使基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子增加，阻斷細(xì)胞外基質(zhì)降解[17]；(4)下調(diào)最重要的促血管生成因子VEGF和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)[11]；(5)下調(diào)乏氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)，它是一種在乏氧環(huán)境中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，激活后轉(zhuǎn)移進(jìn)入核內(nèi)，參與將近40種下游靶基因的表達(dá)，包括糖酵解酶、促紅細(xì)胞生成素、VEGF/FGF等基因。2-ME促進(jìn) HIF-l蛋白降解并抑制HIF-1 核積聚導(dǎo)致微管紊亂，其作用類(lèi)似于紫杉醇[18]。 HIF-1 下調(diào)后除了導(dǎo)致微管紊亂，還能抑制VEGF及VEGFR2的活性，有研究證實(shí)在常氧和乏氧環(huán)境中2-ME以劑量依賴的方式抑制VEGF的分泌，以 HIF-1 獨(dú)立或依賴的途徑抑制VEGFR-2的表達(dá)[19]。

值得注意的是，2-ME的抗血管生成活性并不依賴于對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接效應(yīng)，有研究表明2-ME作用于乳腺癌細(xì)胞48 h后產(chǎn)生的培養(yǎng)基也能抑制毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成，這表明2-ME能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制內(nèi)皮細(xì)胞重建[20]。

3 藥物開(kāi)發(fā)及利用

2-ME對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，臨床前研究得出其具有抗腫瘤增殖、促腫瘤細(xì)胞凋亡、抗血管生成等活性使得2-ME成為潛在的抗癌藥物，進(jìn)而進(jìn)入臨床研究。

研究2-ME抗癌效應(yīng)的第一個(gè)臨床試驗(yàn)的藥物商品名是 PanzemTM，由美國(guó)EntreMed 制藥公司生產(chǎn)。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)聚焦于測(cè)試PanzemTM的藥代動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞毒性特點(diǎn)。臨床試驗(yàn)顯示2-ME具有很好的耐受性，較少的不良反應(yīng)，如胃腸反應(yīng)和疲勞等。在一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，20個(gè)實(shí)體瘤的病人，給予劑量3 000 mg每日2次仍然沒(méi)有達(dá)到最大耐受劑量(the maximum tolerated dose，MTD) 。治療對(duì)微血管密度和細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，最后實(shí)驗(yàn)由于較低的血漿濃度而終止[21]。另一項(xiàng)Ⅰ期實(shí)驗(yàn)研究2-ME對(duì)乳腺癌和前列腺癌的治療效應(yīng)，口服2-ME日劑量達(dá)到1.2 g，雖然此時(shí)前列腺腫瘤生物標(biāo)記物PAS降低，仍然沒(méi)有產(chǎn)生毒性和抗癌效應(yīng)[22]。多個(gè)研究都證實(shí)即使是給予高劑量藥物時(shí)2-ME的血漿濃度仍很低，其原因很可能是較低的水溶性和快速的首過(guò)消除效應(yīng)導(dǎo)致了其較低的口服生物利用度。這可能是抗腫瘤作用弱的原因。

針對(duì)2-ME較低口服生物利用度的特點(diǎn)，多種致力于提高其生物利用度的2-ME新型劑型及衍生物進(jìn)入人們的視野，主要有納米晶體分散系(NanoCrystal dispersion，NCD)、ENMD-0998、STX140等。NCD是1種增加水溶性的新型藥物投遞方法，臨床前研究顯示2-ME-NCD使2-ME的口服生物利用度得到很好改善。而且該藥物每天多次服用比一次服用具有更高的抗癌效應(yīng)。多次服用產(chǎn)生一個(gè)穩(wěn)定的血漿濃度，而穩(wěn)定的血漿濃度正是產(chǎn)生抗癌效應(yīng)所需要的。研究顯示2-ME-NCD 對(duì)順鉑耐藥的晚期卵巢癌和原發(fā)性腹膜癌有良好的耐受性，僅有很少的不良反應(yīng)。雖然NCD使得2-ME擁有更好的生物利用度，合理的穩(wěn)定的血漿濃度水平，可預(yù)測(cè)的2-ME的治療濃度窗，但是其整體抗癌活性仍然較低[5]。一項(xiàng)Ⅱ期研究紫杉醇抵抗的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者，報(bào)道了2-ME-NCD具有很好的耐受性和一定的生物活性，但沒(méi)有出現(xiàn)臨床期望的顯著抗癌療效。該研究計(jì)劃招募50例受試者而僅僅試驗(yàn)了21例就提前結(jié)束，因?yàn)轭A(yù)測(cè)分析6個(gè)月的無(wú)進(jìn)展生存期無(wú)法達(dá)到[23]。總體上這些試驗(yàn)均顯示了2-ME具有良好的耐受性，但由于其效能的問(wèn)題，使得無(wú)法評(píng)估長(zhǎng)期不良反應(yīng)。ENMD-1198是2-ME的一種衍生物，也被稱為C24-883，由 CASI Pharmaceuticals Inc.(Rockville,MD,USA) 生產(chǎn)，一項(xiàng)Ⅰ期實(shí)驗(yàn)研究顯示常見(jiàn)的不良反應(yīng)為2級(jí)疲勞(55%)，惡心、嘔吐(37%)，便秘(34%)，同時(shí)觀察到有2例患者發(fā)生4級(jí)中性粒細(xì)胞減少。ENMD-1198可以阻止微管聚合，降低HIF-1表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，而且生物利用度比2-ME有明顯的增加[21]，所以ENMD-1198是1種很有前途的2-ME衍生物，可以延長(zhǎng)多種腫瘤的無(wú)進(jìn)展生存期，前景可觀，值得進(jìn)一步研究。此外，研究得較多的2-ME衍生物是STX140(2-Methoxyestradiol-3,17-O,O-bis-sulphamate),該化合物包含1個(gè)2-ME分子和C3和C17位上的氨基磺酸基。STX140 的需要?jiǎng)┝棵黠@低于2-ME，較低劑量時(shí)便能抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)STX140對(duì)非腫瘤性的乳腺細(xì)胞活力無(wú)影響，表明它是一種較好的人乳腺癌治療的潛在藥物。

雖然2-ME作為一種單一藥物用于腫瘤治療效果欠佳，但作為輔助用藥表現(xiàn)出更廣闊的前景。(1)聯(lián)合化療：乳腺癌細(xì)胞株中，2-ME聯(lián)合抗雌激素他莫昔芬取得良好的效果。研究表明2-ME和他莫昔芬均能作為芳香化酶抑制劑[24]。另一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中，將子宮內(nèi)膜和卵巢癌細(xì)胞用2-ME預(yù)處理，可見(jiàn)其對(duì)凋亡因子-腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)更加敏感，標(biāo)準(zhǔn)的化療藥物通常對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均有損傷作用，因此通過(guò)2-ME-TRAIL聯(lián)合嘗試增加癌癥細(xì)胞的凋亡同時(shí)降低正常組織的損害取得了一定效果[25]。此外，2-ME聯(lián)合表阿霉素、多西紫杉醇、氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺、卡鉑、硼替佐米等可明顯抑制乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、尿路上皮癌、結(jié)直腸轉(zhuǎn)移癌等細(xì)胞增殖[5]。(2)聯(lián)合放療：課題組也研究了2-ME對(duì)鼻咽癌干細(xì)胞增殖、遷移及放療抵抗性的影響并初步探討其機(jī)制，結(jié)果證實(shí)2-ME可以降低鼻咽癌干細(xì)胞的干性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、鼻咽癌干細(xì)胞對(duì)放療的抵抗作用，有望作為放療增敏藥或者聯(lián)合抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床[26]。(3)聯(lián)合靶向治療：為了提高2-ME生物利用度及其臨床效應(yīng)，PanzemTM與多靶點(diǎn)絡(luò)氨酸激酶抑制劑舒尼替尼聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性腎癌[27]，與血管生成抑制劑貝伐單抗聯(lián)合治療晚期類(lèi)癌[28]，均表現(xiàn)出較好的療效。

4 展 望

2-ME是一種雌激素在體內(nèi)的生理代謝產(chǎn)物，對(duì)多種腫瘤均具有抗癌活性，其抗癌作用的完整機(jī)制仍有待深入探索。在臨床前及臨床試驗(yàn)中均表明其具有很好的耐受性和較低的毒副作用，但由于其低生物利用度限制了其效應(yīng)。幾種提高生物利用度的劑型和衍生物正處于臨床研究中。值得關(guān)注的是，2-ME作為聯(lián)合化療或放療或靶向治療的輔助用藥，均表現(xiàn)出極大的潛力。倡導(dǎo)腫瘤精確治療的今天，2-ME功能與機(jī)制被不斷深入探索，其抗癌效應(yīng)將得到最大的發(fā)揮。