DNA提取方法及在古DNA中的應(yīng)用

張楊　陳虹君　龍歡　楊開勇

摘 要：考古遺址留存下來的人類、動(dòng)物遺骨遺骸和植物殘留是古代生物信息的載體，為我們提供了重要的基因信息。文章概述了幾種古DNA提取常用的方法及原理，并介紹了這些方法在古DNA研究中的一些應(yīng)用實(shí)例。

關(guān)鍵詞：考古；遺骸；古DNA；提取方法

我國(guó)墓葬、考古遺址中經(jīng)常發(fā)掘出土大量豬、馬、牛、羊等動(dòng)物遺骨遺骸、古尸以及植物殘留[1-6]，這些遺存為我們提供了古代動(dòng)物、植物和人類重要的基因信息。古DNA是古代生物的信息載體，作為分子生物學(xué)研究的一個(gè)工具，在建立DNA動(dòng)力學(xué)模型、探索環(huán)境改變與生物多樣性的關(guān)系、詳述滅絕動(dòng)物的飲食、驗(yàn)證過去群落結(jié)構(gòu)和基因流動(dòng)障礙、表現(xiàn)生物兩性的特性、推斷古代和現(xiàn)代人類傳播模式、澄清系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、闡明進(jìn)化發(fā)育生物學(xué)等方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[7-11]。古DNA對(duì)考古學(xué)、古生物學(xué)以及人類學(xué)科具有深遠(yuǎn)的影響，對(duì)于研究物種的起源與進(jìn)化具有重要意義。文章闡述了幾種提取古DNA的主要方法及原理，并列舉了一些應(yīng)用實(shí)例。

1 DNA提取的主要方法

1.1 Chelex-100法

原理：當(dāng)檢材比較少時(shí)或者基因分型僅需要少量的DNA時(shí)，可用Chelex-100提取方法來提取DNA。Chelex-100由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成，是一種螯合樹脂，含有亞氨基二乙酸鹽離子，可以整合多價(jià)金屬離子，且比一般的離子交換劑具有更強(qiáng)的金屬離子選擇性和較高的結(jié)合力，可螯合鎂離子、鈣離子等核酸必需的金屬陽離子，防止DNA降解。在低離子強(qiáng)度、堿性及煮沸的條件下，可使細(xì)胞膜破裂，并使蛋白質(zhì)變性，且結(jié)合其他有可能會(huì)影響進(jìn)一步分析的外源物質(zhì)。經(jīng)過離心，除去了Chelex-100顆粒，同時(shí)使得與DNA結(jié)合在Chelex-100上的物質(zhì)分離，保證了下一步的PCR反應(yīng)，DNA分析也不受抑制劑的干擾[12]。

方法：以血液DNA提取為例。取微量血液用約400μl純水震蕩破碎紅細(xì)胞；13，000r/min離心去上清，收集沉淀；向沉淀中加入200μl5% Chelex-100溶液（使用前要充分振搖），在振蕩器上反復(fù)振蕩，放入56°C保溫30min以上；取出后振蕩混勻，100℃保溫8min，振蕩后，13，000r/min離心3min，上清用于PCR擴(kuò)增，或放4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

應(yīng)用：Chelex-100法適用于血跡、混合斑、毛根、尸骨等生物檢材。整個(gè)提取過程只需在一個(gè)離心管里進(jìn)行，大大減少實(shí)驗(yàn)中污染的可能性，且操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，成本低廉。由于使用這種方法提取出來的DNA純度不太高，且不適合長(zhǎng)期保存，所以在實(shí)驗(yàn)室科研中該方法應(yīng)用較少。

1.2 酚仿抽提法

原理：苯酚使蛋白質(zhì)變性，且抑制DNase的降解，但是苯酚會(huì)微溶于水。氯仿不溶于水，且苯酚易溶于氯仿，所以可以有效去除苯酚，而且還可以萃取出其他脂類雜質(zhì)。異戊醇可以減少蛋白質(zhì)變性過程中產(chǎn)生氣泡，而且還有助于不同溶質(zhì)相的分離，使離心后上層含有DNA的水相、中間變形蛋白相及下層有機(jī)溶劑相保持穩(wěn)定。所以一般酚仿抽提法首先用苯酚抽提，再用25∶24∶1的苯酚-氯仿-異戊醇抽提，最后為了徹底去除苯酚（苯酚對(duì)PCR擴(kuò)增有強(qiáng)烈的抑制作用），采用24：1的氯仿-異戊醇抽提一次，然后用異丙醇或乙醇沉淀DNA。

方法：先用細(xì)胞裂解液和蛋白酶K消化樣品，取上清，加入等體積Tris-飽和酚，緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min，再取上清，加入等體積的25∶24∶1的苯酚-氯仿-異戊醇，緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min，再取上清，加入等體積的24：1的氯仿-異戊醇，緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min，加入0.6～1倍體積異丙醇緩慢搖至沉淀出白色的DNA，4℃低溫12000rpm/min離心5min，棄上清留下DNA沉淀，加入75%乙醇洗滌DNA沉淀，再次離心去上清洗滌DNA，最后離心取上清，留下DNA沉淀，空氣中放置揮發(fā)干凈乙醇，加入60～100?L水溶解DNA。

應(yīng)用：苯酚氯仿法可以用來提取各種生物的各種組織細(xì)胞的DNA，是提取DNA最常用的方法，方法步驟雖然不一，但這種技術(shù)對(duì)于高質(zhì)量DNA提取是十分有效的。但是在提取古DNA過程中，一些色素物質(zhì)在沉淀DNA時(shí)會(huì)一起沉淀，這些物質(zhì)一般都是PCR反應(yīng)中DNA聚合酶的抑制劑，會(huì)影響之后的PCR擴(kuò)增效率。而且實(shí)驗(yàn)過程中需反復(fù)萃取，每一步都有DNA的損失，要求實(shí)驗(yàn)樣品有較高的DNA含量。另外，苯酚、氯仿是有機(jī)溶劑，對(duì)人體和環(huán)境影響較大。因此，現(xiàn)在古代生物樣品的DNA提取通常不采用苯酚氯仿法。

1.3 堿裂解法

原理：堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)染色體DNA與質(zhì)粒DNA在變性和復(fù)性上的差異來達(dá)到分離它們的目的。在pH為12.6的強(qiáng)堿溶液里，染色體DNA的堿基之間的氫鍵會(huì)斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的堿基之間的大多數(shù)氫鍵也會(huì)斷裂，但是超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈?zhǔn)遣粫?huì)完全分離的[13]，當(dāng)以pH為4.8的NaAc緩沖溶液去調(diào)節(jié)其pH到中性時(shí)，變性了的質(zhì)粒DNA又會(huì)恢復(fù)變性之前的構(gòu)型而保存在溶液中，而染色體DNA則不能復(fù)性，形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過離心，染色體DNA及其他大分子物質(zhì)一起被去除。

方法：收集菌液，加入溶菌液，搖動(dòng)混勻，冰浴10min。加入SDS-NaOH溶液冰浴10min。加入pH4.8的NaAC溶液冰浴10min。4℃10000r/min離心10min，小心地把上層清液倒入到另一個(gè)新離心管中，加入預(yù)冷好的無水乙醇，再把離心管放置-20℃冰箱中1h，沉淀析出DNA，離心10min，丟棄上清液，加入無菌水或TE緩沖液溶解DNA。

應(yīng)用：堿裂解法主要用于菌液、動(dòng)物毛發(fā)等樣品的DNA快速提取，其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單、快速，價(jià)格低廉，不需大型儀器設(shè)備。但是不足之處是十分明顯的：一是pH值調(diào)節(jié)不準(zhǔn)確會(huì)導(dǎo)致隨后的PCR擴(kuò)增經(jīng)常失敗，二是提取的DNA中包含大量的蛋白質(zhì)，純度不高，不適合做Southern或其他對(duì)DNA質(zhì)量要求高的實(shí)驗(yàn)。

1.4 二氧化硅（硅粒）法

原理：當(dāng)溶液中的pH值低于或等于二氧化硅表面pKa值時(shí)，二氧化硅表面攜帶的負(fù)電荷就會(huì)減少，與DNA分子帶的負(fù)電荷之間的排斥力也隨之減小，會(huì)形成很多的水合離子，降低了DNA分子的水合程度，DNA分子從而集聚到二氧化硅的表面上。另外，細(xì)胞裂解劑干擾了雙鏈DNA分子之間氫鍵的形成，從而產(chǎn)生了單鏈DNA分子，DNA單鏈分子與二氧化硅表面形成氫鍵，這種氫鍵力遠(yuǎn)高于DNA分子與二氧化硅表面的靜電排斥力。先用洗滌液洗掉吸附有DNA分子的二氧化硅表面的其他雜質(zhì)，再用pH值高于pKa的溶液洗脫吸附在二氧化硅表面上的DNA分子[13]。

方法：采用Rohland N[14]的方法步驟。

應(yīng)用：二氧化硅法是基于常用于提取古DNA的硅粒法的基礎(chǔ)之上而改進(jìn)的，傳統(tǒng)的硅粒法在提取DNA時(shí)僅僅使用了高濃度的異硫氰酸胍來裂解骨粉，這對(duì)骨粉只進(jìn)行了有限的裂解，DNA并沒有完全的釋放出來[15]。本文采取的方法里的提取溶液含有EDTA和蛋白酶K，EDTA的作用是脫鈣，蛋白酶K的作用是消化組織和包圍了DNA的蛋白質(zhì)，兩者結(jié)合使用，可以使骨粉得到更好的裂解，充分釋放出DNA。此方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，可有效去除PCR抑制物，且提取的DNA純度高，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)、大規(guī)模使用，可提取年限久遠(yuǎn)的骨骼DNA。

1.5 試劑盒法

原理：試劑盒法中含有吸附材料，可以特異性地吸附DNA，過濾RNA及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，市場(chǎng)上主要有硅離心試劑盒，磁珠法試劑盒等。

方法：每種試劑盒的操作步驟見各種試劑盒的說明書。

應(yīng)用：試劑盒法操作簡(jiǎn)單、規(guī)范，是提取和純化DNA的比較簡(jiǎn)便的方法，硅離心柱試劑盒在市場(chǎng)上比較普遍，成本低，在提取古DNA研究中比較常用。磁珠法試劑盒提取純化DNA有著更好的效果，在提取古DNA實(shí)驗(yàn)中有著明顯的優(yōu)勢(shì)，但是成本較高[16]。

2 DNA提取方法在古DNA研究中的應(yīng)用案例

Faerman[17]等在提取古骨頭DNA鑒定性別時(shí)，使用了蛋白酶K消化，酚-仿抽提和Chelex純化相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)使用Chelex純化的DNA比不使用Chelex純化的DNA得到了更好的PCR結(jié)果，并且在該實(shí)驗(yàn)中，Chelex的純化效果比其他方法好，可以適用于很少樣本量（少于1mg）的樣本。Tracqui和Ludes[18]在提取古人類骨頭DNA實(shí)驗(yàn)中使用了酚-仿抽提法提取DNA，再用CleanMix purification kit純化DNA，所得的DNA在后續(xù)的PCR擴(kuò)增等步驟中進(jìn)行順利。Maria de Lourdes Mu?oz[19]等人利用3種方法提取前西班牙人（距今200～1500年）的骨頭及組織的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)第1種方法最好。第1種方法：使用提取溶液（0.01M Tris-HCl，0.1 M EDTA and 0.2% SDS pH 8.0）和蛋白酶K消化及溫育后，再用酚-仿抽提法提取，接下來用Amicon? Ultra-0.5 30 kDa columns濃縮。第2種：使用提取溶液（0.01 M Tris-HCl， 0.5 M EDTA pH 8.0），溫育后再使用結(jié)合溶液（5M GuSCN， 0.025 M NaCl， 0.010 M Tris-HCl pH 8.0），然后QIAquick （Qiagen） silica column過濾，最后用TE緩沖液洗脫。第3種：苯酚-氯仿異戊醇（24∶4∶1）提取的DNA與5% Chelex-100在94℃煮10分鐘，再離心。郭麗萍[20]等在研究明代古尸時(shí)使用了經(jīng)典的酚-仿抽提法和Chelex-100法提取肌肉DNA，并用QiAquick PCR Purification Kit （Qiagen）純化，得到了較好的結(jié)果。

Calvignac[21]等對(duì)古熊類樣本進(jìn)行DNA提取時(shí)，先用蛋白酶K和提取溶液進(jìn)行抽提，然后用苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）洗三次上清液，再用Centricon 30 column濃縮DNA并用超純水洗脫，最后用QIAquick kit （QIAGEN）純化。H?ss和P??bo[22]在提取25000年前的馬屬動(dòng)物的DNA時(shí)使用了硅粒法，并將它鑒定為野驢。Rohland和Hofreiter[23]用更新世時(shí)期洞熊的骨頭和牙齒樣本試驗(yàn)了Silica，Centricon，Phenol/chloroform，DNeasy tissue kit，DNeasy tissue kit，DNA IQ system這6種方法，發(fā)現(xiàn)silica方法效果最好，同時(shí)對(duì)silica方法進(jìn)行了優(yōu)化。Dabney[24]等在研究更新世中期洞熊時(shí)用Rohland和Hofreiter的方法提取了35bp～150bp一系列的DNA片段，發(fā)現(xiàn)隨著DNA片段從150bp減少到35bp，提取效率也從75%降到25%。對(duì)此，他們改進(jìn)了該方法，使之在提取35bp的DNA片段時(shí)達(dá)到提取150bp的效率。Cole[25]等報(bào)道了新西蘭古DNA的研究進(jìn)展，包括幾維鳥、查塔姆島鴨和哈斯特鷹等生物，以及骨頭、毛發(fā)、博物館樣品中提取出的古DNA，成功揭露了新西蘭不同生物的進(jìn)化史和系統(tǒng)進(jìn)化樹。

Wood等[26]對(duì)新西蘭北部圖比多灣海岸線共濟(jì)會(huì)酒館考古遺址發(fā)現(xiàn)的距今750年左右的狗糞便化石分析時(shí)，一方面用EDTA、SDS和蛋白酶K溶液消化樣品，取上清液，再用Dneasy Blood & Tissue Kit （Qiagen， Valencia， CA， USA）提取DNA并進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)分析，另一方面用氫氧化鉀和鹽酸對(duì)化石樣品預(yù)處理，再用顯微鏡對(duì)上浮液分析，結(jié)果表明了糞化石來自于歐洲人還未遷移到新西蘭之前的狗，并揭示了這些狗的飲食習(xí)慣。

蔡大偉等[27]使用了基于硅粒法和硅離心柱法的4種方法（方法A ：Modified Silica Particles Method；方法B：Ceneclean Method ；方法 C ：QIA amp Method；方法 D：Modified QIA quick method）提取5個(gè)距今約4000年的線粒體DNA，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)基于硅離心柱方法的PCR成功率明顯優(yōu)于基于硅粒法的方法，Modified QIA quick method的效果最好。Levison等[28]用磁珠法從1.5mL的大腸桿菌JM109細(xì)胞培養(yǎng)中提取到了8.2?g的高質(zhì)量的DNA，從每100?L的大馬哈魚精子水溶里提取到了至少14?L的DNA。樊龍江[29]對(duì)該方法稍作改進(jìn)后，提取古稻樣品的DNA，并用植物界保守通用引物和水稻分子標(biāo)記SSR引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠檢測(cè)，獲得了清晰的目標(biāo)條帶。

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