超聲波輔助酶解鯖魚制備抗氧化肽的研究

周燕芳　楊啟真

摘 要：針對鯖魚魚肉蛋白質(zhì)含量相對較高的特點(diǎn)，利用超聲波輔助酶解制備抗氧化肽。以雙縮脲法測得多肽含量，以對DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的清除率為指標(biāo)，探究制備鯖魚抗氧化肽的最佳工藝條件。結(jié)果表明，最佳的酶解制備條件為：中性蛋白酶加酶量3%、酶解溫度50 ℃、底物濃度4%、超聲波輔助酶解時(shí)間2.5 h，在此條件下，得到的多肽抗氧化能力較強(qiáng)，對DPPH自由基的清除率達(dá)到89.33%，采用中性蛋白酶在超聲波輔助下酶解鯖魚蛋白制備抗氧化肽是可行的。

關(guān)鍵詞：鯖魚；抗氧化肽；超聲波；DPPH清除率；酶解

中圖分類號：TS254 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.006

Abstract： According to the characteristics of high protein content in mackerel， the antioxidant peptides were prepared by ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis. The content of polypeptide was measured by the biuret method， and the DPPH （1，1- two -2- three nitro phenyl hydrazine） free radical scavenging rate was used as the evaluation index to explore the technological conditions for preparing mackerel antioxidant peptides. The results showed that the optimal preparation conditions for enzyme solution was as following： neutral enzyme amount of 3%， the enzymolysis temperature of 50 ℃， substrate concentration of 4%， ultrasonic assisted enzymatic time of 2.5 h. Under these conditions， polypeptide were obtained with strong antioxidant activity， DPPH radical scavenging rate reached 89.33%. It is feasible to prepare antioxidant peptides by enzymatic hydrolysis of mackerel protein by neutral protease.

Key words： mackerel； antioxidant peptides； ultrasonic； DPPH clearance； enzymolysis

隨著海洋生物資源研究的不斷深入，來源于海洋生物的低分子多肽活性和抗氧化性被廣泛認(rèn)可，海洋生物抗氧化肽類大致分為自身存在的活性抗氧化肽及其蛋白質(zhì)降解后產(chǎn)生的活性肽兩類，前者含量相對較少，故活性抗氧化肽來源主要依賴蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生[1]?？寡趸钚噪囊话闶呛?0～30個(gè)氨基酸組合、分子量小于6 000 Da的多肽化合物，易被人類腸道所吸收利用。因此，作為海洋生物重要物種的魚類成為生物抗氧化肽的理想來源 [2]。目前對魚類中多肽的研究已有很多報(bào)道，多集中于魷魚[3]、大黃魚[4]、鳙魚[5]等。鯖魚又名鯖花魚，俗名鮐魚、青鲇魚、油胴魚、鯖魚、青條魚，是我國重要的中上層經(jīng)濟(jì)魚類之一，此種魚類分布廣、生長快、產(chǎn)量高，且具有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)20%以上，除鮮食外還可腌制和做罐頭，同時(shí)亦是生物抗氧化肽的理想來源，但目前有關(guān)采用超聲波協(xié)同酶解鯖魚獲得抗氧化肽方面的研究尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)主要通過超聲波輔助蛋白酶對鯖魚蛋白進(jìn)行酶解制備抗氧化肽，并對酶解得到的多肽抗氧化性進(jìn)行研究，旨在對鯖魚的進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

臨海鯖魚鮮肉凍塊剔骨打漿后，平鋪置于試驗(yàn)盤中冰箱冷凍，呈塊狀。

1.2 試驗(yàn)試劑和儀器

中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶均由銳陽生物科技有限公司提供；牛血清蛋白（BSA）由上海如吉生物科技發(fā)展有限公司提供；DPPH（ 2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味酰肼自由基）由日本TCI原裝進(jìn)口；其他試劑均為市售分析純。

FA2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；722S可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；85-2恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東省鄄城永興儀器廠）；玻璃儀器氣流烘干器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SDH-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（上海丞明儀器設(shè)備有限公司）；高速離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶解前處理鯖魚 除去魚鱗、魚內(nèi)臟、魚頭和魚尾，剔除魚頭留下魚肉，冷凍、備用。

1.3.2 酶解制備工藝單因素試驗(yàn) （1）最適蛋白酶篩選。試驗(yàn)設(shè)置中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶4個(gè)處理。稱取定量鯖魚樣品，配制成底物濃度為4%的魚蛋白液，置于攪拌器中持續(xù)攪拌15 min作為樣液，將4組樣液置于恒溫55 ℃、功率120 W的超聲波清洗機(jī)中，恒溫超聲5 min后，分別按4%的加酶量（加酶質(zhì)量占底物質(zhì)量的百分比，下同）加入4組樣品中，恒溫超聲波輔助酶解1 h，完成后置于沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫后抽濾，濾液用蒸餾水定容，測定其肽含量和抗氧化能力，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，篩選出效果最佳的蛋白酶，作為后續(xù)試驗(yàn)用酶。

（2）最適加酶量篩選。試驗(yàn)設(shè)置1%，2%，3%，4%，5%，6% 6個(gè)加酶量處理。6組4%魚蛋白液，置于溫度55 ℃，超聲波功率120 W的超聲波清洗機(jī)中，分別按6個(gè)加酶量加入（1）中篩選出的最佳蛋白酶，充分酶解1 h，滅酶、抽濾、定容，取樣測定，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，篩選出最適加酶量，作為后續(xù)試驗(yàn)加酶量。

（3）最適底物濃度篩選。分別配制為1%，2%，3%，4%，5%，6%6個(gè)底物濃度的鯖魚魚蛋白液，將6組樣液置于超聲波功率120 W，溫度55 ℃的超聲波清洗機(jī)中，按照（2）中的最適加酶量添加（1）中的最佳蛋白酶，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，反應(yīng)1 h，滅酶、抽濾、定容，取樣測定。

（4）最適酶解溫度篩選。設(shè)置40，45，50，55，

60，65 ℃ 6個(gè)酶解溫度處理。按最適底物濃度配制鯖魚魚蛋白液，將六組樣液分別置于功率120 W的超聲波清洗機(jī)中，分別按各處理溫度控制溫度，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，加入蛋白酶，反應(yīng)1 h，滅酶、抽濾、定容，取樣測定。

（5）最適超聲波輔助酶解時(shí)間篩選。設(shè)置0.5，

1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h 6個(gè)酶解時(shí)間。按最適底物濃度配制鯖魚魚蛋白液，將6組樣液置于功率120 W超聲波清洗機(jī)中，控制最佳溫度，加入蛋白酶，分別按6個(gè)酶解時(shí)間進(jìn)行恒溫超聲波輔助酶解，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，酶解后進(jìn)行滅酶、抽濾、定容，取樣測定。

1.3.3 酶解制備工藝正交試驗(yàn) 通過對單因素結(jié)果分析，篩選出3個(gè)主要影響因素：底物濃度、溫度和加酶量開展正交試驗(yàn)，使用L9（33）確定鯖魚蛋白酶解的最佳酶解工藝[9]（表1）。

1.3.4 酶解液的肽含量測定 （1）雙縮脲試劑。 取3.0 g硫酸銅和9.0 g酒石酸鉀鈉C4O6H4KNa·4H2O溶于500 mL蒸餾水中，攪拌加入300 mL 10%的NaOH溶液，用蒸餾水定容至1 000 mL，儲存（如果存儲時(shí)間過久溶液底部有黑色的沉淀產(chǎn)生需要重新配置[6]）。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確稱取0.1 g的牛血清蛋白BSA，加入適量蒸餾水溶解，多次洗滌后，將溶液及其洗滌液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容至100 mL。取6支試管分別移取0，0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0 mL的1 mg·mL-1的牛血清蛋白溶液，并補(bǔ)水至1 mL，搖勻后再在各個(gè)試管中加入4 mL雙縮脲試劑，混勻后室溫靜置30 min，4 000 r·min-1離心10 min后用玻璃比色皿在可見分光光度計(jì)上測定各個(gè)樣品在540 nm波長下的吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）酶解液的抗氧化能力測定（DPPH自由基清除率的測定）[7] 。準(zhǔn)確移取2 mL定容后的樣液與2 mL（0.15 mmol·L-1）DDPH（使用無水乙醇準(zhǔn)確配置），混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，置于離心機(jī)中4 000 r·min-1離心10 min，于517 nm處測吸光值為Ai，同時(shí)用同樣的方法測定2 mL蒸餾水與0.15 mmol·L-1的DPPH 2 mL的吸光度，記為吸光度A0，以及2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度為Aj。

DPPH自由基清除率（P）按如下公式計(jì)算[8]。

P= ×100% （1）

分析各種試樣的DPPH清除率并做出曲線圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel和ChemExcel1.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖、結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解法制備鯖魚抗氧化肽單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 最適蛋白酶篩選 由圖1、圖2可知，鯖魚蛋白可被不同的蛋白酶酶解，酶解液中存在的活性肽大多具備一定的抗氧化性，但在其他條件均相同的情況下，蛋白酶種類不同，所得多肽含量也不同，多肽對DPPH自由基的清除率也不同，其中以中性蛋白酶作為酶解用酶，所得到的活性肽含量及其對DPPH自由基的清除率顯著高于其他3種蛋白酶，故選擇中性蛋白酶為后續(xù)試驗(yàn)用酶。

2.1.2 最適加酶量篩選 由圖3、圖4可知，隨著加酶量的增加，鯖魚蛋白酶解液的多肽含量和DPPH清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中在加酶量為3%時(shí)達(dá)到峰值，多肽含量為13.15 mg·mL-1，DPPH的清除率為83.75%。

2.1.3 最適底物濃度篩選 由圖5可知，隨著底物濃度的增加，酶解獲得的肽含量平緩增加，但差異不顯著，至底物濃度4%時(shí)，肽含量達(dá)到一定峰值，隨后有所下降。這可能是由于底物濃度低時(shí)，酶用量一定的情況下，與酶接觸的底物越多，被酶作用后轉(zhuǎn)變?yōu)殡牡牧烤驮蕉?；?dāng)達(dá)到一定程度后，酶的量起到限制作用，所以肽含量不再增加。由圖6可知，底物濃度1%時(shí)，酶解后所得多肽對DPPH清除率顯著低于其他處理，其他處理間差異不顯著，說明在底物濃度>2%后，底物濃度的增加沒有明顯提高DPPH清除率，超過4%時(shí)，甚至有一定程度的降低，這可能是由于底物濃度過高，在加酶量一定的情況下，酶解受加酶量的制約，因此，肽含量和DPPH清除率均下降。綜合得出，最佳的底物濃度為4%。

2.1.4 酶解溫度篩選 從圖7、圖8可以看出，在溫度40～50 ℃時(shí)，多肽含量以及DPPH清除率隨著酶解溫度的增加而增加，在溫度為50 ℃時(shí)，多肽含量以及DPPH清除率均達(dá)到最大值；溫度超過50 ℃之后，DPPH清除率以及肽的含量呈現(xiàn)出下降的趨勢，這是由于溫度增高，超過了酶解的最適溫度，導(dǎo)致酶解速率降低，抗氧化肽生成減少。由此可知，超聲波酶解最適溫度為50 ℃左右。

2.1.5 酶解時(shí)間的篩選 由圖9，10可知，隨著酶解時(shí)間的增加，肽含量和DPPH清除率增加，在酶解時(shí)間2.5 h時(shí)效果最佳；之后隨著酶解時(shí)間的增加，多肽含量和DPPH清除率有下降趨勢，可能由于酶解時(shí)間過長，抗氧化肽緩慢被酶解成氨基酸，因此，超聲波酶解時(shí)間過短或過長均會對酶解產(chǎn)生不利影響，最佳的酶解時(shí)間控制在2.5 h左右比較合適。

2.2 正交優(yōu)化鯖魚抗氧化肽的制備試驗(yàn)結(jié)果分析

結(jié)合單因素試驗(yàn)，選擇底物濃度、酶解溫度和加酶量3個(gè)因素開展正交試驗(yàn)，對酶解制備抗氧化肽的條件進(jìn)行優(yōu)化[10]，結(jié)果詳見表2。

從表2可以看出，經(jīng)R值分析排列各類因素影響DPPH清除率以及活性抗氧化肽的主次順序?yàn)椋杭用噶?gt;酶解溫度>底物濃度，通過表格K值分析得出最佳的實(shí)驗(yàn)因素組合為A2B2C2，即為加酶量3%，酶解溫度50 ℃，底物濃度4%。

根據(jù)正交試驗(yàn)篩選的最佳試驗(yàn)因素組合，進(jìn)行3次重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)[11]，得出DPPH清除率平均值為89.33%，高于單因素各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，從而驗(yàn)證得出，A2B2C2為最佳的鯖魚抗氧化肽酶解制取工藝。

3 結(jié) 論

利用蛋白酶酶解鯖魚蛋白制備抗氧化多肽方法是可行的，以肽含量和多肽對DPPH自由基的清除率為指標(biāo)，結(jié)合單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)篩選最佳制備工藝的條件為：酶解溫度50 ℃、底物濃度4%、中性蛋白酶加酶量3%，超聲波輔助酶解時(shí)間2.5 h，在此條件下，得到的多肽抗氧化能力較強(qiáng)， DPPH自由基的清除率達(dá)到89.33%。

目前，蛋白質(zhì)酶解法是制備抗氧化肽的最佳工藝，其操作簡潔，準(zhǔn)確高效，鯖魚的進(jìn)一步開發(fā)利用可考慮酶解制備多肽這一路線，這為鯖魚的深加工以及相關(guān)食品開發(fā)提供了參考和依據(jù)。

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