CAR-T技術(shù)的作用機(jī)制及其在惡性淋巴瘤中的應(yīng)用*

劉 暢，蔣 婷，全詩(shī)翠，紀(jì) 青 綜述，鄧 飛 審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，貴州遵義 563000，2.南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院病理科，廣東深圳 518000)

惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是我國(guó)較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占所有惡性腫瘤的3%～4%[1]。目前，大多數(shù)的ML尚不能治愈且復(fù)發(fā)率及病死率較高，近年來(lái)不斷涌現(xiàn)的新的基因治療及靶向治療等對(duì)ML的臨床緩解率均有限[2]。2013年，《Science》雜志總結(jié)了本年度科學(xué)界十大突破性技術(shù)，其中腫瘤的免疫治療高居榜首[3]。嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)療法作為一種特殊的腫瘤免疫治療方式，以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在惡性腫瘤，尤其是淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了令人矚目的成績(jī)。

1 CAR-T的作用機(jī)制

1989年，GROSS等[4]首次提出CAR-T細(xì)胞的概念，他們發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞具有顯著地增強(qiáng)抗腫瘤的效能，可以通過(guò)不依賴主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)的方式識(shí)別任何靶點(diǎn)，而不僅僅是識(shí)別蛋白。從此，CAR-T技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。近年來(lái)CAR-T技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于多種惡性腫瘤的臨床研究當(dāng)中，其中以淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤的效果最為顯著。

1.1CAR的基本結(jié)構(gòu) CAR由細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)肽區(qū)組成。細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)通常來(lái)源于單克隆抗體的單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)，scFv具有特異性識(shí)別并結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)的功能,這種單鏈抗體不需要依賴MHC就可直接識(shí)別位于腫瘤細(xì)胞表面的靶抗原，從而克服腫瘤的免疫逃逸機(jī)制[5]。其構(gòu)成是由TAA的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)用一條可彎曲的多肽接頭連接起來(lái)；鉸鏈區(qū)一般為CD8α、TCR β等免疫球蛋白序列，其具有變形和伸縮的活性，為細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)接近抗原提供條件；胞內(nèi)信號(hào)肽區(qū)通常由共刺激分子(costimulatory molecule，CM)和免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)組成，負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；跨膜區(qū)是CD3、CD4、CD8、CD28等蛋白分子，是CAR的二聚化和T細(xì)胞活化的關(guān)鍵區(qū)域[6-7]。

1.2CAR的發(fā)展歷程 目前CAR已發(fā)展到第4代。最初的CAR僅含有ITAM，只使用CD3復(fù)合體中的ζ-鏈作為惟一的信號(hào)域，這就是所謂的第1代CAR。近年來(lái)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的這種第1代CAR對(duì)于T細(xì)胞的激活是不完整的，其發(fā)揮的抗腫瘤作用有限，于是有研究者在此基礎(chǔ)上在胞內(nèi)區(qū)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)加入CM如CD28和或CD137[8-9]，可以提升T細(xì)胞的抗腫瘤持久性和抗腫瘤活性，因此出現(xiàn)了2代和3代的CAR。有研究用第1代CD19-CAR和第2代CD19-CAR(包含CD28共刺激分子)治療慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)[10]，研究表明2代CAR比1代CAR顯示了更好的抗腫瘤持久性，說(shuō)明了第2代和第3代CAR與第1代CAR相比，對(duì)于T細(xì)胞活化更加的完整，具有更強(qiáng)的攻擊效應(yīng)[8,11]。但第3代CAR是否優(yōu)于第2代CAR，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證，目前進(jìn)行臨床研究的多為2代CAR。

第4代CAR又稱(chēng)TRUCKs(fourth-generation CAR T-cells redirected for universal cytokine killing)，結(jié)構(gòu)與前3代不同的是其引入了炎癥介質(zhì)(如IL-12)和共刺激配體，這樣能夠提升這些改造過(guò)的T細(xì)胞的擴(kuò)增活性和壽命從而引起更為廣泛的抗腫瘤效應(yīng)[11-12]。并且，只要腫瘤細(xì)胞表面存在靶抗原，第4代CAR就可以充分地降低腫瘤負(fù)荷，在無(wú)需預(yù)處理的情況下就可以產(chǎn)生抗腫瘤作用，同時(shí)這樣也可以使患者免受預(yù)處理治療時(shí)發(fā)生不良反應(yīng)[13]。

1.3CAR-T技術(shù)的作用原理 CAR-T技術(shù)是利用基因工程技術(shù)將TAA的特異性識(shí)別和T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性相結(jié)合，通過(guò)一定途徑將編碼CAR的基因轉(zhuǎn)染到T淋巴細(xì)胞內(nèi)，使這種經(jīng)基因修飾過(guò)的T細(xì)胞表達(dá)特異性的CAR，然后在體外擴(kuò)增、純化此T細(xì)胞，這種T細(xì)胞就可以通過(guò)非MHC限制的方式識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的特定抗原，特異性靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[6-7]。

2 CAR-T技術(shù)在ML中的應(yīng)用

ML是較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占所有惡性腫瘤的3%～4%，占我國(guó)各種惡性腫瘤發(fā)病的第11位[1]。按照病理組織學(xué)的不同可分為HL和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)。目前，ML的傳統(tǒng)治療是以化療為主，放療為輔，但是治愈率和臨床緩解率均較低，復(fù)發(fā)和難治常常是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。異基因造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)作為挽救和根治ML的一個(gè)方案，而實(shí)際骨髓移植之后長(zhǎng)期生存患者也僅占2/3[14]。CAR-T技術(shù)作為一種新興的過(guò)繼免疫治療，具有抗腫瘤作用的同時(shí)卻不會(huì)產(chǎn)生骨髓抑制等不良反應(yīng)且患者耐受性較好。

研究表明，大多數(shù)的NHL和B淋巴細(xì)胞白血病均表達(dá)CD19抗原，因此，建立針對(duì)CD19抗原的CAR-T細(xì)胞靶向治療顯示出良好的應(yīng)用前景，且該類(lèi)CAR-T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)當(dāng)中取得了令人振奮的療效[15-16]?？梢哉f(shuō)，到目前為止在CAR-T技術(shù)上，最著名的研究是用CD19+CAR-T細(xì)胞對(duì)CD19+B細(xì)胞惡性腫瘤患者的治療。早在2010年，來(lái)自美國(guó)國(guó)立癌癥研究院(National Institutes of Health，NIH)的KOKENBERGER等[17]首先采用輸注抗CD19+CAR-T細(xì)胞的方法治療晚期濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，F(xiàn)L)1例，該患者在治療后得到了持續(xù)的完全緩解(CR)，療效明顯。鑒于此，該團(tuán)隊(duì)隨后又于2013年報(bào)道了更大樣本量的研究結(jié)果，同樣得到了令人振奮的成果[18]。在接受抗CD19+CAR-T治療的10例患者中，其中1例CLL患者得到了持續(xù)生物CR，1例CLL患者出現(xiàn)腫瘤溶解綜合征，還有1例套細(xì)胞淋巴瘤(mantel cell lymphoma，MCL)患者得到了持續(xù)的部分緩解(PR)，且該10例患者均沒(méi)有發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)(graft-versus-host disease，GVHD)。最近，他們又完成了后續(xù)研究，該項(xiàng)研究共治療包括9例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)，2例惰性淋巴瘤和4例CLL。在其中可被評(píng)估的13例患者中，有8例CR(包括4例DLBCL)，4例PR，1例病情穩(wěn)定[19]。

在2015年的第57屆美國(guó)血液學(xué)會(huì)(ASH)年會(huì)上，TURTLE等[20]報(bào)道了在給患者輸注CAR-T細(xì)胞前給予氟達(dá)拉濱+環(huán)磷酰胺(FC方案)化療預(yù)處理的治療。預(yù)處理的目的是清除免疫抑制細(xì)胞，從而提高CAR-T療法的療效。該研究共治療28例B細(xì)胞NHL和6例CLL。在28例NHL中，包括DLBCL 18例、FL 6例和MCL 4例。在28例NHL中，其中有12例接受了單獨(dú)的環(huán)磷酰胺(無(wú)氟達(dá)拉濱)預(yù)處理，50%有療效[CR 1例(DLBCL)， PR 5例(2例 FL，2例 DLBCL，1例 MCL)， 無(wú)臨床反應(yīng)6例]，CR率為8%；而另外接受FC方案的16例NHL中，其中的12例被評(píng)估(2例沒(méi)有被評(píng)估，2例早期死亡)，整體有效率為67%(CR 5例，PR 3例)，CR率為42%。在6例CLL中，3例 CR，1例 PR，2例無(wú)反應(yīng)，CR率為50%。在所有CR的患者中，在治療后CR持續(xù)了1～10個(gè)月不等。

3 CAR-T技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

綜上所述，CAR的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)能不受MHC識(shí)別腫瘤抗原，不需要經(jīng)過(guò)抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)。(2)腫瘤表面的脂類(lèi)抗原也可以作為靶點(diǎn)，而不再僅局限于蛋白類(lèi)抗原。(3)CM(如CD28、CD137等)能使CAR的免疫效應(yīng)更強(qiáng)大、持久。

但是CAR-T技術(shù)也存在一定的不足之處。盡管目前研究的樣本量不是很大，無(wú)法得出一個(gè)系統(tǒng)的結(jié)論，但是各種臨床上治療惡性腫瘤常見(jiàn)的不良反應(yīng)它都具有。更關(guān)鍵的是，CAR-T細(xì)胞與TAA具有高度的親和性，容易因識(shí)別失誤而攻擊正常細(xì)胞，導(dǎo)致誤傷現(xiàn)象，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為“脫靶效應(yīng)”。因此需要選擇特異性表達(dá)于腫瘤表面的靶抗原來(lái)避免此不良反應(yīng)的發(fā)生。對(duì)于脫靶效應(yīng)，可通過(guò)靜脈補(bǔ)充免疫球蛋白(如IgA、IgG等)來(lái)緩解。在2010年，報(bào)道了結(jié)腸癌伴遠(yuǎn)處肝、肺轉(zhuǎn)移的患者因?yàn)槊摪行?yīng)而造成死亡[21]，也直接促使美國(guó)重組DNA委員會(huì)(Reorganization of the DNA Committee in the United States，RDAC)召開(kāi)會(huì)議針對(duì)性研究，要求減少輸注CAR-T細(xì)胞的劑量，推動(dòng)第2代與第3代CAR的運(yùn)用。

另一個(gè)需要重視的不良反應(yīng)就是細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine release syndrome，CRS)[22]，嚴(yán)重的CRS出現(xiàn)概率在27%～53%，常發(fā)生于接受細(xì)胞治療后6～20 d。其發(fā)生機(jī)制是T細(xì)胞活化后，在短時(shí)間內(nèi)清除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，引發(fā)炎性反應(yīng)，從而釋放出大量細(xì)胞因子導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放綜合。臨床表現(xiàn)主要有發(fā)熱、心動(dòng)過(guò)速、低血壓、毛細(xì)血管滲透綜合性以及呼吸系統(tǒng)癥狀等。目前，對(duì)于這種細(xì)胞因子釋放綜合征的治療措施可采用激素沖擊和IL-6受體抑制劑，可以降低因CRS造成的死亡率。

此外，CAR-T細(xì)胞療法相對(duì)來(lái)說(shuō)是一種“個(gè)性化”療法，這也就意味著CAR-T細(xì)胞制備的成本比較昂貴，預(yù)計(jì)每例患者的治療費(fèi)用至少要30～50萬(wàn)美元，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了普通家庭的承擔(dān)能力，所以其臨床的廣泛應(yīng)用將受限。

4 展 望

CAR-T 技術(shù)的出現(xiàn)是對(duì)淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤治療方法的變革，為難治性、復(fù)發(fā)性ML患者帶來(lái)了新的希望。經(jīng)過(guò)多年的臨床試驗(yàn)研究表明，CAR-T治療ML尤其是B細(xì)胞淋巴瘤的療效十分肯定，雖然已經(jīng)有許多進(jìn)步，但到目前為止，顯著的局限性仍然存在。 如不良反應(yīng)CRS，還有高昂的治療費(fèi)用，限制了其療效和臨床應(yīng)用。雖然在臨床廣泛應(yīng)用前還需要克服許多障礙，但由于CAR-T療法具有良好的抑瘤活性，仍很有可能成為臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域的主流。對(duì)于未來(lái)CAR-T技術(shù)的研究方向?qū)▋?yōu)化生成的CAR-T細(xì)胞，不僅要著眼于提高其有效性，如何縮減其制造成本和時(shí)間成本也是迫切需要解決的問(wèn)題。相信在不久的將來(lái)，CAR-T技術(shù)不僅可以廣泛應(yīng)用于淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，還能為應(yīng)用于其他實(shí)體瘤提供理論依據(jù)。

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