工業(yè)微生物菌種的保藏方法

王 利

海正藥業(yè)（杭州）有限公司 浙江 杭州 311404

正文：

微生物資源是我國重要的戰(zhàn)略生物資源。微生物產(chǎn)業(yè)已成為繼動植物之后的第三大生物產(chǎn)業(yè)。歐美發(fā)達(dá)國家生產(chǎn)總值的8%-12%與微生物有關(guān)。微生物產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值不斷增長，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)境、能源等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。工業(yè)微生物菌株作為生物發(fā)酵生產(chǎn)的源頭，對發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量有著重要的影響，是保證發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。保存方法的合理與否對保持菌株的優(yōu)良特性至關(guān)重要。

1 概述

1.1 微生物菌株的定義是一個(gè)基本的分類單元，是表型特征高度相似、關(guān)系密切、與同屬其他菌株差異明顯的一大類菌株的總稱。目前工業(yè)生產(chǎn)中最常見的微生物是細(xì)菌、放線菌和真菌。

1.2 微生物菌株在繁殖過程中會受到環(huán)境條件的影響而不斷變化，大部分變化與工業(yè)生產(chǎn)目標(biāo)的預(yù)期不一致，為負(fù)變化。在工業(yè)生產(chǎn)中，由于重要性狀屬于數(shù)量性狀，因此具有負(fù)向變化的傾向。隨著代數(shù)的增加，當(dāng)陰性細(xì)胞占有一定優(yōu)勢時(shí)，細(xì)菌就會發(fā)生降解。正確的保存方法是在保存過程中減少細(xì)菌的自發(fā)性傳播，從而減少細(xì)菌降解的機(jī)會

1.3 一般是通過菌株在缺氧、缺水、低溫、低營養(yǎng)條件下的貯藏來抑制菌株的新陳代謝，使其通過停滯甚至進(jìn)入休眠狀態(tài)。在實(shí)踐中，低溫保存細(xì)菌的效果往往更好。例如-195(-液氮或低溫冰箱)的效果優(yōu)于-70(-干冰或低溫冰箱)，-70℃優(yōu)于-20℃，-20℃優(yōu)于4℃。

2 工業(yè)微生物菌種的保存方法

2.1 邊坡低溫保存方法。

細(xì)菌應(yīng)該每月移植一次。傾斜應(yīng)變應(yīng)連續(xù)保存三代，以控制和防止事故和污染造成的損失。該方法的孵育時(shí)間和溫度影響其保鮮質(zhì)量。培養(yǎng)時(shí)間短，保鮮過程中容易死亡，培養(yǎng)時(shí)間長，生產(chǎn)效率高。這種方法常用于實(shí)驗(yàn)室儲存。其優(yōu)點(diǎn)是保存操作簡單，菌株使用方便，沒有特殊設(shè)備，能夠?qū)Ρ４婢赀M(jìn)行死亡、突變和污染檢測。適用于不需要長期保存或凍干保存的菌株。該方法的缺點(diǎn)是貯存時(shí)間短，菌株易發(fā)生突變，菌株在貯存過程中維護(hù)多樣，菌株容易被污染。

2.2 液體石蠟的保存。

礦物油保藏法，又稱礦物油保藏法，是常規(guī)移植保藏法的補(bǔ)充方法，由法國呂米埃于1914年創(chuàng)立。具體操作如下:(1)選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟單獨(dú)包裝并塞好，用牛皮紙包好，用濕熱滅菌(滅菌后烘干)或干熱滅菌對石蠟進(jìn)行滅菌，無菌檢查后保存。(2)斜培養(yǎng)獲得較強(qiáng)的真菌或孢子。(3)在無菌條件下，將石蠟注入細(xì)菌生長的斜坡。石蠟的用量應(yīng)比坡頂高1厘米，以隔離空氣中的細(xì)菌。該方法實(shí)用有效。真菌、放線菌和孢子菌可保藏2-10年，酵母可保藏1-2年，非孢子菌可保藏1年左右，即使是一般方法難以保藏的腦膜炎球菌也可保藏3個(gè)月。此外，本方法不適用于石蠟為碳源的微生物保藏或?qū)κ炋貏e敏感的微生物保藏。

2.3 干燥保存方法。

微生物芽孢或芽孢在干燥環(huán)境中對死亡的抵抗力很強(qiáng)，干燥可以使其代謝活性降低到休眠狀態(tài)。干保存法是將菌株接種到合適的材料中，人為創(chuàng)造干燥環(huán)境，達(dá)到菌株保存的目的。干燥保鮮的載體可以是沙子、濾紙、硅膠、麥麩等。干燥保鮮的方法有冷凍干燥和真空干燥。以濾紙保藏方法為例，將細(xì)胞或孢子吸附在濕無菌濾紙上，干燥后低溫(如4c)保存，細(xì)菌和酵母可以保存2年左右，一些絲狀真菌甚至可以保存14-17年。該方法具有貯存時(shí)間長、維護(hù)簡單、無特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 超低溫保存方法

該方法通常將菌株保存在液氮或低溫-150～195c的冰箱中，甘油和二甲基亞砜通常用作菌株的保護(hù)劑。通常微生物的代謝幾乎完全停滯在-130攝氏度以下，因此低溫貯藏被認(rèn)為是世界上最有效的防止細(xì)菌降解的方法。隨著制冷技術(shù)的發(fā)展，超低溫保鮮已有幾十年的歷史，廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵菌種的保鮮。本方法適用于各種微生物菌株的保存，包括支原體、原生動物、藻類等。該方法將含有保護(hù)劑的細(xì)菌懸液密封在無菌冷凍管中，然后緩慢冷凍。理想的冷卻和速凍溫度為1C/min。當(dāng)溫度逐漸下降到-35c時(shí)，微生物懸液迅速被放入液氮罐或深冷冰箱中。當(dāng)細(xì)菌再次培養(yǎng)時(shí)，它們需要迅速融化，然后在適當(dāng)?shù)臏囟认略谝后w培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.5 上述方法可以根據(jù)菌株本身的特點(diǎn)、菌株保存的目的以及實(shí)驗(yàn)室的具體條件和需要進(jìn)行選擇。特定的保存方法(包括保護(hù)劑的選擇)應(yīng)該通過實(shí)驗(yàn),來研究,最好是為每個(gè)應(yīng)變采用以上兩種方法,并根據(jù)保存菌株的保質(zhì)期,定期進(jìn)行恢復(fù)測試和更新菌株進(jìn)入。

3 對我國細(xì)菌保護(hù)的思考與建議

3.1 加強(qiáng)統(tǒng)籌規(guī)劃。我國文物保護(hù)中心的數(shù)量比較多，且規(guī)模比較大，管理內(nèi)容比較復(fù)雜，所以，在實(shí)際管理的時(shí)候，很容易出現(xiàn)管理混亂問題，無法有效保障管理質(zhì)量。為了保證微生物資源的管理效果，應(yīng)建立起專門的微生物資源體系，并將其統(tǒng)一保存在儲存機(jī)構(gòu)，各個(gè)保存機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)地區(qū)的環(huán)境特點(diǎn)以及自然條件來進(jìn)行菌株保存。每個(gè)機(jī)構(gòu)都有自己的職能，可以互補(bǔ)彼此的優(yōu)勢。例如，一個(gè)或幾個(gè)保存機(jī)構(gòu)專注于真菌，而其他機(jī)構(gòu)專注于病毒。

3.2 建立專項(xiàng)運(yùn)營組織。我國必須要加強(qiáng)對細(xì)菌保管機(jī)構(gòu)管理的重視，建立起專門的細(xì)菌菌株保管機(jī)構(gòu)，確保菌株可以得到有效保管。同時(shí)，還需要對菌株訂購信息進(jìn)行不斷的更新，運(yùn)營機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)菌種的實(shí)際特點(diǎn)，來選擇合理、可行的運(yùn)營模式，并采用各種運(yùn)營手段，來增加用戶數(shù)量，使細(xì)菌市場得到有效擴(kuò)展。

3.3 建設(shè)信息平臺。確保信息共享，并防止資源浪費(fèi)問題的發(fā)生，促進(jìn)國內(nèi)外保護(hù)組織的交流與合作。中國應(yīng)該建立一套通用的互聯(lián)網(wǎng)信息平臺，將國內(nèi)大大小小的菌種庫連接起來，形成信息網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)資源的交換。每個(gè)應(yīng)變存儲單元都可以依賴于同一個(gè)大數(shù)據(jù)存儲系統(tǒng)，借助軟件的幫助，可以將所有應(yīng)變信息錄入系統(tǒng)，并與網(wǎng)絡(luò)同步，供每個(gè)單元進(jìn)行查閱和交換。