誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向表皮干細(xì)胞分化的研究進(jìn)展*

王 曉,鄒立津,曾元臨 綜述,張友來(lái) 審校

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷中心，南昌 330006)

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS)是通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化體細(xì)胞，使已分化細(xì)胞“原始化”并具備干細(xì)胞特性。2006年日本京都大學(xué)首次成功創(chuàng)建iPS細(xì)胞[1]，該研究利用攜帶 Oct3/4、Sox2、C-Myc和Klf4轉(zhuǎn)錄因子的4種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染成纖維細(xì)胞后經(jīng)篩選獲得iPS。2007年TAKAHASHI等[2]研究顯示，利用此技術(shù)同樣可以誘導(dǎo)人皮膚纖維母細(xì)胞成為幾乎與胚胎干細(xì)胞完全一樣的多能干細(xì)胞。與此同時(shí)，YU等[3]也報(bào)道了利用Oct3/4、Sox2、Nanog 和 Lin28的基因組合成功使人類(lèi)新生兒成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞。隨后國(guó)內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室利用基因?qū)氲姆椒ㄍ瓿闪硕喾N類(lèi)型成體細(xì)胞向iPS細(xì)胞的重編程。iPS細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)、DNA甲基化方式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動(dòng)物等方面與胚胎干(ES)細(xì)胞幾乎完全一致。iPS細(xì)胞具有多向分化潛能，在體內(nèi)可以分化為3個(gè)胚層來(lái)源的所有細(xì)胞，使其成為疾病治療種子細(xì)胞的良好選擇。經(jīng)特定條件誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向上皮干細(xì)胞分化有望解決臨床皮膚缺損所面臨的皮源不足的問(wèn)題。本文就iPS細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化及其在皮損修復(fù)領(lǐng)域的研究做一綜述。

1 iPS細(xì)胞向表皮分化的誘導(dǎo)方法的研究

1.1細(xì)胞培養(yǎng)基 iPS細(xì)胞由體細(xì)胞經(jīng)導(dǎo)入外源基因重編程而來(lái)，與ESCs在功能和表型上相似，具有無(wú)限擴(kuò)增和保持正常核型及生成3個(gè)胚層細(xì)胞的能力，在細(xì)胞治療中具有良好的應(yīng)用前景。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中多依賴動(dòng)物血清及滋養(yǎng)層細(xì)胞，限制了干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)獲取，且血清中含有的多種成分對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響也難以控制，探索無(wú)血清培養(yǎng)體系勢(shì)在必行。李向東等[4]使用無(wú)血清培養(yǎng)基mTeSRTM1培養(yǎng)復(fù)蘇的ESCs，能夠在體外進(jìn)行長(zhǎng)期擴(kuò)增,同時(shí)維持其未分化的干細(xì)胞潛能。目前iPS細(xì)胞培養(yǎng)基仍然沿用ESC等細(xì)胞培養(yǎng)基做為基礎(chǔ)，而適宜培養(yǎng)iPS細(xì)胞的特定培養(yǎng)基尚需要進(jìn)一步探索研制。

1.2細(xì)胞分化影響因子

1.2.1傳統(tǒng)細(xì)胞分化影響因子 生長(zhǎng)因子的種類(lèi)及數(shù)量常影響干細(xì)胞分化效率。研究常用的有EGF、bFGF、TGF-β等，這些因子都可一定程度上促進(jìn)iPS細(xì)胞分化。近年在iPS細(xì)胞向表皮干細(xì)胞分化的研究中，李勇鐵等[5]將iPS細(xì)胞置于人羊膜上培養(yǎng)后部分細(xì)胞出現(xiàn)整合素β1和CK19的表達(dá)，表明人iPS細(xì)胞可在羊膜誘導(dǎo)下定向分化為表皮樣干細(xì)胞，但其機(jī)制尚不清楚。ITOH等[6]通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基成分，在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化為擬胚體后，經(jīng)調(diào)整后的培養(yǎng)基(去除bFGF，添加抗壞血酸、TGF-β2及ITS-A)培養(yǎng)10 d后得到成纖維細(xì)胞及表皮樣干細(xì)胞。有研究表明CDX2和LGR5的表達(dá)經(jīng)FGF2作用明顯上調(diào)，當(dāng)細(xì)胞在含EGF和低濃度的FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng),腸上皮細(xì)胞的特定標(biāo)記物的mRNA均得以表達(dá),同時(shí)也檢測(cè)到蔗糖酶異麥芽糖酶蛋白的表達(dá)及β-Ala-Lys-Amca的吸收[7]，這為iPS細(xì)胞向類(lèi)腸上皮細(xì)胞分化提供一簡(jiǎn)單直接的方法。有研究通過(guò)細(xì)胞中脂質(zhì)沉積以及C3補(bǔ)體蛋白的高表達(dá)從而證實(shí)iPS細(xì)胞具有分化為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的潛能，他們?cè)谡T導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞暴露在博來(lái)霉素或TGFB1/EGF混合物中時(shí)會(huì)經(jīng)歷表型改變包括獲得間質(zhì)/成纖維細(xì)胞形態(tài)、間充質(zhì)標(biāo)記物上調(diào)及表面蛋白和鈣黏蛋白的下調(diào)[8]。KODAMA等[9]也證實(shí)了促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)、DNA甲基化酶(DNMT)及TGF-β抑制劑可促進(jìn)iPS細(xì)胞向腸上皮分化。由此可以看出，iPS細(xì)胞分化中各種因子均會(huì)影響分化過(guò)程及效率，而在特定分化中何種因子起作用及其權(quán)重至今仍是未知。

1.2.2維甲酸與骨形成蛋白4 維甲酸(RA)是與胚胎外胚層發(fā)育相關(guān)的誘導(dǎo)因素，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在皮膚組織中大量表達(dá)一種RA特定受體，表明RA也可能參與皮膚的分化過(guò)程。骨形成蛋白4(BMP4)和RA均可促進(jìn)外胚層向神經(jīng)分化，并已有研究證實(shí)了BMP4在皮膚修復(fù)中具有促愈合作用。近年的此類(lèi)研究中SALIMI等[10]對(duì)比3個(gè)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)媒介(bFGF+EGF、RA和毛猴素+IBMX)促進(jìn)iPS細(xì)胞神經(jīng)分化的潛力，經(jīng)免疫熒光染色及定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)分析表明,毛猴素+IBMX處理的已分化hiPS細(xì)胞的神經(jīng)基因的表達(dá)明顯高于未分化細(xì)胞及其他處理組，證明經(jīng)毛猴素+IBMX處理的hiPS細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)系細(xì)胞的效率更高。另外在眼科研究中，LI等[11]通過(guò)4種特定因子(Noggin、BMP4/7、BFGF、EGF)的組合,分3步影響iPS細(xì)胞分化，高效地生成晶狀體上皮細(xì)胞LECs，從而為解決LECs傳代不能保持原代特性的問(wèn)題提供新途徑。雖然較多研究證實(shí)RA和BMP4可促進(jìn)iPS細(xì)胞的分化，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

1.2.3其他影響因素 很多學(xué)者在分化體系中添加其他特殊分子或改變細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，明顯改變了干細(xì)胞的分化效率及分化結(jié)果。KUSUMA等[12]發(fā)現(xiàn)低氧分壓可促進(jìn)iPS細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞：在5%O2無(wú)飼養(yǎng)層二維分化系統(tǒng)中，iPS細(xì)胞分化的內(nèi)皮細(xì)胞群中帶有內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白和CD31的細(xì)胞數(shù)增加、動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物及條索狀結(jié)構(gòu)形成，提示氧分壓在iPS細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中的重要性。OFFEN等[13]利用小鼠iPS細(xì)胞來(lái)源的泛神經(jīng)祖細(xì)胞研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子促紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)細(xì)胞的生存、增殖和神經(jīng)分化的影響。在增殖培養(yǎng)中EPO(0.1～3.0 U/mL)輕度改善細(xì)胞生存但減少細(xì)胞增殖和神經(jīng)球的形成，在分化培養(yǎng)中通過(guò)β-Ⅲ-微管蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的增加評(píng)估EPO促進(jìn)神經(jīng)分化，證實(shí)EPO抑制iPS細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)祖細(xì)胞的自我更新，促進(jìn)其向神經(jīng)分化。

2 iPS細(xì)胞向表皮分化的基因研究

iPS細(xì)胞向表皮分化的實(shí)質(zhì)是誘導(dǎo)多能性細(xì)胞內(nèi)表皮基因的表達(dá)。有文獻(xiàn)[14]查詢了聯(lián)合微陣列數(shù)據(jù)庫(kù)487種生長(zhǎng)因子及受體的表達(dá)，表明hES/iPS細(xì)胞表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性的抑制、早期分化標(biāo)記物的非表達(dá)及標(biāo)準(zhǔn)多能性基因的穩(wěn)定表達(dá)，為iPS細(xì)胞的多能性提供了理論支持。BORNACHEAD等[15]在研究小鼠表皮腫瘤細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，TP63基因編碼兩個(gè)主要類(lèi)型(TAp63和δNp63)之一的δNp63可促進(jìn)iPS細(xì)胞重編輯相關(guān)因子的表達(dá),表明它具有可以調(diào)節(jié)小鼠表皮腫瘤細(xì)胞的特殊干細(xì)胞特征。CHEN等[16]在研究iPS細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR199b在內(nèi)皮細(xì)胞分化中表達(dá)呈漸進(jìn)性增加，以JAG1作為靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)STAT3途徑引起VEGF的轉(zhuǎn)錄激活和分泌。利用shRNA-mediated敲除JAG1則其在內(nèi)皮細(xì)胞分化中的調(diào)控效應(yīng)消失，表明miR199b在iPS細(xì)胞分化為血管細(xì)胞過(guò)程中，經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)臨界的血管生成信號(hào)的應(yīng)答，扮演著一個(gè)表型轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)器的角色。

多能干細(xì)胞由已分化細(xì)胞重編程而來(lái)，其表觀遺傳背景可以影響其轉(zhuǎn)錄和功能性行為，PETROVA等[17]比較分析iPS細(xì)胞系iKCL004和iKCL011，培養(yǎng)后miRNA數(shù)組大約7%的CpG位點(diǎn)出現(xiàn)不同的甲基化，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞系iKCL004克隆中,與皮膚屏障作用成熟相關(guān)的毛透明蛋白(TCHH)保留了一種原始體細(xì)胞DNA甲基化特點(diǎn),而iKCL011的TCHH甲基化特點(diǎn)與人類(lèi)胚胎干細(xì)胞系KCL034相匹配。SHAO等[18]經(jīng)過(guò)比較初始MSC、ESC-MSC、iPS-MSC的DNA甲基化修飾得出，iPS-MSC在DNA甲基化修飾中保留了供者來(lái)源的差異性，即供體表觀遺傳差異的組織記憶，iPS-MSC存在一些CpG位點(diǎn)顯示顯著差異，證明iPS-MSC克隆了較少的個(gè)體變化但他們保持供體來(lái)源的表觀遺傳差異。

3 病體來(lái)源iPS細(xì)胞上皮分化及在疾病治療中的研究

iPS細(xì)胞技術(shù)的最終目的是應(yīng)用于臨床疾病治療、疾病模型制作及藥物篩選等方面。在未來(lái)臨床應(yīng)用中，iPS細(xì)胞的來(lái)源也必然是取自于患者自體細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、外周血細(xì)胞等較為容易獲取的細(xì)胞。核重編程使患者特異性iPS細(xì)胞成為可能，因此誘導(dǎo)病體來(lái)源iPS細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞的研究尤為重要。目前病體來(lái)源iPS細(xì)胞上皮分化仍處于實(shí)驗(yàn)階段，此技術(shù)應(yīng)用于臨床還為時(shí)過(guò)早，但分化獲得的上皮細(xì)胞為表皮修復(fù)提供了良好的前景。

3.1糖尿病 糖尿病患者常發(fā)皮膚感染導(dǎo)致皮膚受損，且創(chuàng)面恢復(fù)困難，尤以糖尿病足多見(jiàn)。CHAN等[19]將1型糖尿病患者來(lái)源的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)形成的內(nèi)皮細(xì)胞系，具有典型的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，帶有結(jié)合凝集素、乙?；兔芏戎鞍讛z取、基底膜管腔形成、對(duì)TNF-α應(yīng)答的能力，在工程透明質(zhì)酸或體內(nèi)缺氧條件下，可經(jīng)受形態(tài)變化形成3D結(jié)構(gòu)，且能合并至轉(zhuǎn)基因脈管系統(tǒng)中。ORLOVA等[20]也得出了相同結(jié)果，證實(shí)體細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞在體內(nèi)外能分化成所有類(lèi)型內(nèi)皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞且擁有其全部功能。有研究[21]以2型糖尿病患者的表皮細(xì)胞為來(lái)源獲得多能干細(xì)胞，誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞獲得了以延長(zhǎng)端粒和抑制衰老相關(guān)基因p15(INK4b)/ p16(INK4a)基因表達(dá)以及氧化應(yīng)激信號(hào)為特征的重生的狀態(tài)，為創(chuàng)面修復(fù)提供了良好的種子細(xì)胞，同時(shí)以遺傳特異性因子逐步引導(dǎo)(包括IV和GLP-1)，再分化iPS細(xì)胞成為可生產(chǎn)胰島素的細(xì)胞子代，為糖尿病病因治療提供可能。

3.2斑禿 斑禿被認(rèn)為是一種具有遺傳性質(zhì)及環(huán)境激發(fā)因素的自身免疫性疾病，是由炎性細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性疾病，與免疫失調(diào)相關(guān)[22]，毛囊再生是斑禿治療中需解決的首要問(wèn)題。2013年VERAITCH等[23]利用人類(lèi)iPS細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)鼠身上成功再生了部分毛囊，此外實(shí)驗(yàn)中還指出，在201B7 iPSc系、WD39 iPSc系和WDT2 iPSc系中，201B7 iPSc系能使毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞的表面標(biāo)記(角蛋白18、角蛋白14 及人腫瘤蛋白TP63等)的表達(dá)明顯高于其他兩系。有學(xué)者利用H9系人類(lèi)胚胎干細(xì)胞/iPS細(xì)胞生成神經(jīng)嵴細(xì)胞，然后將其誘導(dǎo)為可刺激毛發(fā)生成的類(lèi)毛乳頭細(xì)胞(類(lèi)毛乳頭細(xì)胞可表達(dá)有成熟毛乳頭細(xì)胞的特征性標(biāo)志)，研究人員將這些細(xì)胞移植到免疫缺陷的裸鼠中成功誘導(dǎo)了毛囊形成[24]，證實(shí)人類(lèi)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)形成的真皮乳頭與人類(lèi)iPS細(xì)胞誘導(dǎo)形成的真皮乳頭兩者誘導(dǎo)毛囊形成的能力相當(dāng)。2014年，YANG等[25]先將Oct3/4、Sox-2和Klf4轉(zhuǎn)入人類(lèi)皮膚成纖維細(xì)胞中獲得iPS細(xì)胞，然后將其誘導(dǎo)分化為毛囊隆突部上皮干細(xì)胞，繼而將誘導(dǎo)分化的上皮干細(xì)胞植入免疫功能缺陷的小鼠體內(nèi)再生出功能性的人類(lèi)表皮和毛囊，甚至生成了結(jié)構(gòu)可識(shí)別的毛干。

3.3其他 在其他病體研究中，ITOH等[26]成功將大皰性表皮松解癥患者來(lái)源的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角質(zhì)形成細(xì)胞并制備了3D皮膚結(jié)構(gòu)，證實(shí)了所獲得iPS細(xì)胞具有高度的多能性并能應(yīng)用于皮損修復(fù)?？谇话┲委煶?dǎo)致周?chē)M織大量的永久性的丟失，PATEL等[27]探討了重編程技術(shù)在口腔癌后期康復(fù)中的應(yīng)用，他們以口腔癌患者口腔上皮細(xì)胞為來(lái)源，誘導(dǎo)其重編程為iPS細(xì)胞，為口腔鱗癌患者組織缺損的再生提供了希望。KAJIWARA等[28]采用來(lái)自于唐氏綜合征和雙胎輸血綜合征個(gè)體的羊水細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為表皮細(xì)胞，聯(lián)合人的I型膠原及成纖維細(xì)胞建立三維皮膚，于孕期作用于小鼠模型，可在孕期成功覆蓋胎兒脊膜膨出癥(MMC)缺損部位，為產(chǎn)前治療MMC提供了一種可能。

4 展 望

利用iPS細(xì)胞技術(shù)獲取表皮干細(xì)胞并應(yīng)用于皮損修復(fù)，首先要解決iPS細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題。iPS細(xì)胞為再生醫(yī)學(xué)提供無(wú)限的細(xì)胞來(lái)源，雖然關(guān)于iPS細(xì)胞技術(shù)的研究眾多，研究者們通過(guò)采取多種措施影響誘導(dǎo)過(guò)程，但其誘導(dǎo)效率仍然很低，且向分化體系中加入各類(lèi)因子均會(huì)不同程度的影響分化結(jié)果，目前各分化體系中影響因子的種類(lèi)仍然在繼續(xù)探索中。其次，iPS細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的效率是制約其應(yīng)用于皮損修復(fù)的一大阻礙。SAKURAI等[29]將小鼠iPS細(xì)胞經(jīng)RA和BMP4預(yù)培養(yǎng)后鋪于Ⅳ型膠原上，誘導(dǎo)分化成表達(dá)p63和K14的上皮細(xì)胞，然而K14陽(yáng)性細(xì)胞不到60%，且并未在體內(nèi)外證實(shí)這種細(xì)胞能否形成上皮組織。有研究將此類(lèi)細(xì)胞與真皮成纖維細(xì)胞混合植入裸鼠皮下形成含包囊及皮脂腺的皮膚組織[30]，但此種誘導(dǎo)需形成胚胎小體，此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量其他類(lèi)型的細(xì)胞，必須在分化過(guò)程中進(jìn)行細(xì)胞的提純和再次接種，很難產(chǎn)生臨床所需的大量皮膚干細(xì)胞。另外，iPS細(xì)胞經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染外源基因?qū)?，?dǎo)入基因多為癌相關(guān)基因，理論上獲得的細(xì)胞仍存在癌性和干性的爭(zhēng)議。病體來(lái)源細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核酸在分化過(guò)程中積累的變異是否會(huì)影響形成的iPS細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)外的核酸，并進(jìn)而影響其分化為表皮干細(xì)胞的效率及表觀遺傳特性，此方面的研究尚未報(bào)道，因此如何去除供體細(xì)胞基因組外的影響因素將是后續(xù)iPS細(xì)胞技術(shù)研究的新方向。

有學(xué)者使用單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子OCT4暫時(shí)性轉(zhuǎn)染人皮膚角化細(xì)胞，經(jīng)功能鑒定證實(shí)新分化的間充質(zhì)細(xì)胞膠原凝膠的收縮和真正的肌成纖維細(xì)胞一樣有效，因此獲得特定的細(xì)胞可能不需要完全重新編程體細(xì)胞成為iPS細(xì)胞，OCT4的瞬時(shí)表達(dá)足以改變?nèi)私琴|(zhì)細(xì)胞的分化途徑[32]。日本厚生勞動(dòng)省2013年正式批準(zhǔn)利用iPS細(xì)胞開(kāi)展視網(wǎng)膜再生研究，在全球范圍內(nèi)首獲政府批準(zhǔn)并用于臨床試驗(yàn)。近日來(lái)日本數(shù)家制藥及化工企業(yè)首次利用iPS細(xì)胞量產(chǎn)血小板，這是iPS細(xì)胞走向臨床的重要一步。iPS細(xì)胞技術(shù)將不止局限在簡(jiǎn)單分化，誘導(dǎo)獲得上皮細(xì)胞并形成皮片組織是否能夠具有正常皮膚的功能將是急需解決的一大問(wèn)題，通過(guò)誘導(dǎo)在不久的將來(lái)或許可以看到iPS細(xì)胞來(lái)源的含血管的多層皮片組織產(chǎn)品，以用于大面積深度皮瓣缺損的修復(fù)。自體和同種異體干細(xì)胞包括ESCs和iPS細(xì)胞組織工程再生醫(yī)學(xué)具有良好前景,預(yù)計(jì)不久越來(lái)越多的產(chǎn)品將出現(xiàn)在市場(chǎng)上。