電針耳穴通過(guò)SIRT1/PGC-1α途徑延緩D-半乳糖致衰老豚鼠聽(tīng)皮層老化△

帥常娟 劉淑云 姚宇 楊燁 殷澤登

氧化應(yīng)激是細(xì)胞氧化-抗氧化失衡而導(dǎo)致的應(yīng)激損傷狀態(tài)，研究證實(shí)氧化應(yīng)激是導(dǎo)致老化的重要原因之一[1～3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1, SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷依賴的蛋白脫乙?；?，可通過(guò)脫乙?；せ钸^(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α (peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator 1α, PGC-1α)等底物調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[4～7]。PGC-1α是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化酶的表達(dá)，提高組織抗氧化能力[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)聽(tīng)覺(jué)中樞老化可能與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性降低所導(dǎo)致的抗氧化功能下降有關(guān)，電針“聽(tīng)宮”和“翳風(fēng)”兩個(gè)穴位可提高SOD活性，能在一定程度上抑制D-半乳糖所致的豚鼠聽(tīng)覺(jué)中樞的老化過(guò)程[9]，但有關(guān)通過(guò)電針耳穴提高聽(tīng)覺(jué)中樞抗氧化能力的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不清楚。研究表明，SIRT1/PGC-1α途徑參與年齡相關(guān)性骨骼肌老化萎縮和聽(tīng)力損失過(guò)程[10～12]。本研究擬從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)D-半乳糖致年齡相關(guān)性聾豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1、PGC-1α表達(dá)，并觀察電針“聽(tīng)宮”穴和“翳風(fēng)”穴對(duì)其表達(dá)的影響，探討SIRT1/PGC-1α 途徑在年齡相關(guān)性聾豚鼠聽(tīng)皮層老化過(guò)程中的作用以及電針耳穴是否通過(guò)SIRT1/PGC-1α途徑調(diào)節(jié)聽(tīng)皮層的老化過(guò)程。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取耳廓反射靈敏、無(wú)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史的4月齡豚鼠30只(體重230～400 g)，隨機(jī)分為對(duì)照組、D-半乳糖模型組(簡(jiǎn)稱模型組)、D-半乳糖模型+電針組(簡(jiǎn)稱電針組)，每組10只；以18月齡豚鼠10只(體重500～700 g)為老年組。豚鼠均由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1D-半乳糖致年齡相關(guān)性聾豚鼠造模 參照李君梅等建立的方法[9]，模型組及電針組豚鼠頸背部皮下注射D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1，對(duì)照組予以注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。老年組豚鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不作任何處理。在飼養(yǎng)過(guò)程中，仔細(xì)觀察各組動(dòng)物的外觀及表現(xiàn)。

1.2.2電針?lè)椒?清醒狀態(tài)下，電針組豚鼠固定后取雙側(cè)“聽(tīng)宮”穴和“翳風(fēng)”穴[13, 14]，用HM6805-I型經(jīng)穴治療儀(HM6805-I型，1100801072，四川恒明科技開(kāi)發(fā)有限公司)刺激，疏密波，頻率14 Hz，強(qiáng)度0.4～0.6 mA，連續(xù)輸出，9次/秒，持續(xù)刺激15 min，每天一次，連續(xù)6周。刺激強(qiáng)度以針刺附近豚鼠耳廓顫動(dòng)，四肢輕抖動(dòng)但不掙扎嘶叫為度[15]。

1.2.3ABR檢測(cè) 采用Kong等[16]建立的方法進(jìn)行ABR檢測(cè)。豚鼠造模及電針結(jié)束后，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉滿意后置于隔聲屏蔽室內(nèi)，環(huán)境溫度(25±3) ℃，應(yīng)用聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位儀(Intelligent Hearing Systems, 美國(guó))測(cè)試。記錄電極置于顱頂，參考電極置于雙側(cè)耳廓背面，接地電極置于鼻尖。刺激聲為短聲，雙耳同時(shí)刺激、記錄，聲刺激強(qiáng)度從100 dB SPL 開(kāi)始，掃描時(shí)間25 μs，疊加次數(shù)為1 024次，刺激間隔19.30次/秒，最大刺激強(qiáng)度為132 dB SPL，刺激強(qiáng)度按10 dB遞減，接近閾值時(shí)，按5 dB遞減,記錄各組ABR反應(yīng)閾。

1.2.4動(dòng)物聽(tīng)皮層取材 ABR測(cè)試完成后，動(dòng)物麻醉未醒前，迅速斷頭，暴露顱腔，參照Schofield等[17]的方法對(duì)雙側(cè)聽(tīng)皮層解剖定位后于無(wú)菌臺(tái)上取出，立即用4 ℃生理鹽水洗凈血跡后凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)聽(tīng)皮層SIRT1、PGC-1α mRNA的表達(dá) 聽(tīng)皮層于液氮中研磨后，按照離心柱型RNA提取分離試劑盒(DP419, 北京天根生化科技有限公司，中國(guó))的步驟提取總RNA。用分光光度計(jì)(ND-100, NanoDrop公司, 美國(guó))測(cè)定總RNA的濃度和純度，并通過(guò)電泳鑒定其完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-201, TOYOBO, 日本)說(shuō)明，以所提取的RNA為模版逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴(kuò)增。參考Khan-Malek等[18]的方法對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PCR引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物相關(guān)信息

1.2.6Western Blot法檢測(cè)豚鼠聽(tīng)皮層組織SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá) 蛋白提取后，采用BCA法測(cè)定蛋白含量。4%濃縮膠和10%分離膠分離蛋白質(zhì)樣品，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V；采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶進(jìn)行封閉，SIRT1蛋白一抗(9475s, 上海優(yōu)寧維科技股份有限公司, 中國(guó))、PGC-1α蛋白一抗(ab54481, 上海復(fù)申生物科技有限公司, 中國(guó))和內(nèi)參一抗(β-actin)4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，二抗(bs-0295G-HRP, 北京博奧森生物技術(shù)有限公司, 中國(guó))置于脫色搖床上低速震蕩室溫孵育1 h。底物發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照。使用Quantity one凝膠成像系統(tǒng)分析條帶的灰度值，為避免人為因素的誤差，采用目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參灰度的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行半定量檢測(cè)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用單因素方差分析，方差齊時(shí)，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組豚鼠ABR閾值 對(duì)照組、模型組、電針組和老年組的ABR閾值分別為：35.75±4.66、74.5±5.59、44.4±7.92和76.5±7.8 dB SPL。與對(duì)照組比較，模型組和老年組ABR閾值升高(P模型組<0.00 1；P老年組<0.00 1)；與模型組和老年組相比，電針組ABR閾值降低(P<0.00 1)；模型組與老年組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.344)。

2.2豚鼠聽(tīng)皮層STR1/PGC-1α mRNA表達(dá) 各組豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1/PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，老年組和模型組SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)降低(P老年組SIRT1=0.02;P老年組PGC-1α<0.00 1;P模型組SIRT1=0.01;P模型組PGC-1α<0.00 1)；與模型組比較，電針組SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)增加(P電針組SIRT1=0.011,P電針組PGC-1α<0.00 1)；與老年組相比較，電針組SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)增加(P電針組SIRT1=0.016；P電針組PGC-1α<0.001)；模型組和老年組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PPGC-1α=0.536;PSIRT1=0.814)。

表2 各組豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1、PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量

注：★與對(duì)照組比較；◆與模型組比較；△與老年組比較，P<0.01

2.3豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1/PGC-1α蛋白表達(dá)

各組豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)變化見(jiàn)表3、圖1、2。與對(duì)照組比較，老年組和模型組SIRT1、PGC-1α蛋白水平降低(P老年組SIRT1<0.001;P老年組PGC-1α<0.001;P模型組SIRT1<0.001;P模型組PGC-1α<0.001)；與模型組比較，電針組SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)增加(P電針組SIRT1<0.001,P電針組PGC-1α<0.001)；與老年組相比較，電針組SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)增加(P電針組SIRT1<0.001；P電針組PGC-1α<0.001)；模型組和老年組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PPGC-1α=0.753;PSIRT1=0.282)。

表3 聽(tīng)皮層SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值

注：▲與對(duì)照組比較；●與模型組比較；*與老年組比較，P<0.01

圖1 各組豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1蛋白表達(dá)

圖2 各組豚鼠聽(tīng)皮層PGC-1α蛋白表達(dá)

3 討論

3.1SIRT1/PGC-1α途徑在年齡相關(guān)性聾豚鼠聽(tīng)皮層老化中的作用

應(yīng)用D-半乳糖用于年齡相關(guān)性聾動(dòng)物造模具有造模簡(jiǎn)單、周期相對(duì)較短的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛用于衰老相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究[19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用D-半乳糖造模的年齡相關(guān)性聾豚鼠可表現(xiàn)出與自然衰老豚鼠相一致的聽(tīng)力下降，機(jī)體氧化損傷加重，抗氧化酶活性降低，聽(tīng)覺(jué)中樞老化[9,15,20]。本研究顯示，模型組豚鼠與對(duì)照組相比ABR反應(yīng)閾增高，但與老年組相比，無(wú)明顯差異，提示D-半乳糖致年齡相關(guān)性聾豚鼠模型構(gòu)建成功。

前期研究發(fā)現(xiàn)，聽(tīng)皮層的老化可能與SOD活性降低所導(dǎo)致的抗氧化功能下降有關(guān)[9]，但其具體機(jī)制目前尚不清楚。近年來(lái)有研究表明，SIRT1/ PGC-1α信號(hào)途徑在氧化應(yīng)激時(shí)，可促進(jìn)抗氧化酶類表達(dá)增加，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[21,22]。Di Emidio等[23]研究發(fā)現(xiàn)SIRT1的下游因子錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)是位于線粒體中的關(guān)鍵抗氧化酶，過(guò)表達(dá)SIRT1可通過(guò)上調(diào)Mn-SOD保護(hù)小鼠卵母細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組和老年組豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1和PGC-1α在mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)均顯著下調(diào)，說(shuō)明SIRT1下調(diào)可能參與D-半乳糖致年齡相關(guān)性聾豚鼠的聽(tīng)皮層老化。Xue等[24]研究發(fā)現(xiàn)，老年C57BL/6小鼠耳蝸毛細(xì)胞的凋亡與SIRT1和PGC-1α的表達(dá)降低有關(guān)，過(guò)表達(dá)SIRT1顯著增加了耳蝸毛細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá)，減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙，從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示與對(duì)照組相比較，模型組和老年組豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1和PGC-1α表達(dá)下調(diào)，這可能與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體功能障礙，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)。由此推測(cè)，豚鼠聽(tīng)皮層的老化可能是由于SIRT1/PGC-1α表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致SOD活性下降所致。

3.2電針耳穴通過(guò)SIRT1/PGC-1α 途徑延緩年齡相關(guān)性聾豚鼠聽(tīng)皮層老化

年齡相關(guān)性聾目前尚無(wú)有效的治療藥物[25]。電針耳穴不僅能提高毛細(xì)胞及耳蝸血管紋細(xì)胞線粒體酶的活性，保障細(xì)胞能量供應(yīng)[26]，而且還能促進(jìn)聽(tīng)神經(jīng)纖維的再生[27]。前期研究表明，電針可以促進(jìn)聽(tīng)皮層 β-catenin蛋白表達(dá)[20]、改善聽(tīng)皮層糖代謝和促進(jìn)聽(tīng)皮層 IGF-1表達(dá)，從而改善聽(tīng)力[28]。本研究結(jié)果顯示，電針組豚鼠ABR閾值較老年組和模型組明顯降低，表明電針在一定程度上能改善年齡相關(guān)性聾豚鼠的聽(tīng)功能。Dong等[29]研究發(fā)現(xiàn)，電針可通過(guò)上調(diào)SIRT1依賴的PGC-1α的表達(dá)，從而改善SAMP8小鼠腦的能量代謝。Jung等[30]研究發(fā)現(xiàn)電針可通過(guò)減少活性氧及其相關(guān)酶的產(chǎn)生，從而改善缺血性腦卒中患者血腦屏障功能，減輕腦水腫。這些研究說(shuō)明電針能調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激功能。本研究結(jié)果顯示，電針組豚鼠聽(tīng)皮層SIRT1和PGC-1α的mRNA和蛋白表達(dá)高于模型組和老年組，說(shuō)明電針耳穴能提高SIRT1和PGC-1α的表達(dá)，本課題組前期研究也證實(shí)了電針可提高SOD的活性；說(shuō)明電針能在一定程度上通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激抑制D-半乳糖所致的豚鼠聽(tīng)皮層的老化過(guò)程[9]。

綜上所述，電針可能通過(guò)上調(diào)SIRT1/PGC-1α的表達(dá)，提高SOD的活性，提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，從而延緩年齡相關(guān)性聾豚鼠聽(tīng)皮層的老化過(guò)程，但其具體機(jī)制有待繼續(xù)研究。

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