熱鍛煉對杜鵑花耐熱性的影響

梁 雯，趙 冰，黃文梅

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌712100）

高溫會引起植物細(xì)胞成分、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和新陳代謝的變化［1-2］，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物葉片萎蔫甚至死亡，是限制植物分布及生長的主要環(huán)境因子。與動(dòng)物相比，植物不能移動(dòng)，只能利用自身抵抗熱害的能力來應(yīng)對自然界中出現(xiàn)的高溫?zé)岷Γ@種抵抗熱害的能力就是耐熱性［3］。植物的耐熱性可以通過施用生長調(diào)節(jié)劑，如鈣（主要為氯化鈣）［4］、水楊酸［1-3］等或高溫鍛煉來提高。植物在非致死高溫處理（即熱鍛煉）下可以獲得耐熱性［5-9］，通過感知溫度信號并將這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成生物化學(xué)過程來啟動(dòng)溫度鍛煉，最終導(dǎo)致耐熱性的發(fā)展［8］。熱鍛煉處理能使植物葉肉細(xì)胞及葉綠體在高溫下保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［8,10］，減少活性氧積累［8］，提高抗氧化酶活性，調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)積累［11］，減少光抑制［12］等，從而提高植物耐熱性。熱鍛煉能提高亞洲百合Asiatic lilies［13］，灰?guī)r皺葉報(bào)春Primula forrestii和滇北球花報(bào)春Primula denticulate ssp.sinodenticulata［10］，菊花Chrysanthemum［11］等園林植物的耐熱性，但針對熱鍛煉提高杜鵑花Rhododendron耐熱性的研究迄今亦未見報(bào)道。周廣等［14］通過多年對杜鵑花的引種馴化研究，發(fā)現(xiàn)高溫?zé)岷κ怯绊懚霹N花引種馴化和應(yīng)用的主要因子。探究如何提高杜鵑花的耐熱性，使其更加廣泛地應(yīng)用到園林中，是園林工作者亟待解決的問題。本研究以杜鵑花品種 ‘狀元紅’Rhododendron ‘Zhuangyuan Hong’生長健壯植株為試材，研究熱鍛煉對植物葉片解剖結(jié)構(gòu)、光合作用和生理特征（包括細(xì)胞膜系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)以及酶促抗氧化系統(tǒng)）變化的影響，揭示熱脅迫下熱鍛煉處理對杜鵑花耐熱性的影響及其作用機(jī)理，為杜鵑花的引種馴化以及園林應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試杜鵑花品種 ‘狀元紅’購于浙江嘉善，在陜西楊凌新天地日光溫室［溫度（25±1）℃］培養(yǎng)，生長健壯。選取栽植于塑料盆里的大小一致的 ‘狀元紅’18盆，1株·盆-1。栽培基質(zhì)為V（松針）∶V（泥炭土）=1∶2。試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓人工氣候箱中進(jìn)行，處理光照度約為12 000 lx， 光周期14 h，相對濕度80%?；ㄅ桦S機(jī)擺放，2 d澆1次水并互換位置以減少位置的影響。試驗(yàn)開始前所有植株在22℃下適應(yīng)3 d，隨后隨機(jī)選擇一半植株移到30℃下熱鍛煉處理6 d，另一半依然置于22℃作為對照。6 d后，將處理組和對照組植株各取6盆并分成2組，轉(zhuǎn)移到重度高溫（38℃）和極端高溫（42℃）下進(jìn)行6 d脅迫試驗(yàn)，并把經(jīng)過熱鍛煉的余下的3盆轉(zhuǎn)移到人工氣候箱（22℃）培養(yǎng)6 d。整個(gè)試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)處理（表 1）。

表1 試驗(yàn)中的6個(gè)處理Table 1 6 treatments in this trial

1.2 解剖結(jié)構(gòu)觀察

處理結(jié)束后選取各盆植株從頂端開始數(shù)的第3片葉，將它們迅速切成3 mm×1 mm大小，用體積分?jǐn)?shù)為4%的戊二醛溶液固定過夜，之后用磷酸緩沖液漂洗，梯度乙醇依次脫水，并進(jìn)行乙酸異戊酯置換，用K-850CO2臨界點(diǎn)干燥儀（Quorum，英國）干燥，E-1045離子濺射儀（HITACHI，日本）噴金，再用JSM-6360LV鎢燈絲掃描電子顯微鏡（JEOL，日本）進(jìn)行觀察拍照，記錄葉片柵欄、海綿等組織排列情況。用Nano Measure 1.2測量軟件測量葉片葉肉組織厚度，并計(jì)算柵欄海綿組織比、葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度（RS）和葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度（RCT）。柵欄海綿組織比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度×100%；葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度（RS）=海綿組織厚度/葉片厚度×100%；葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度（RCT）=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%。

1.3 光合參數(shù)測定

使用LI-6400便攜式光合熒光儀（LI-COR，美國）測定葉片的凈光合速率（Pn），氣孔導(dǎo)度（Gs），蒸騰速率（Ts），細(xì)胞間隙二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)（Ci）。測定時(shí)葉室面積為6 cm2，樣品室流速設(shè)為500 μmol·s-1。

1.4 保護(hù)酶活性及可溶性物質(zhì)等的測定分析

處理結(jié)束后選取植株中部葉位的葉片測定各項(xiàng)生理參數(shù)。稱取葉片0.1 g·次-1，重復(fù)測定3次。利用過氧化氫（H2O2）測試盒（南京建成生物工程研究所，A064）測定過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度。采用蒽酮比色法測定可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，試劑盒法測定可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（南京建成生物工程研究所，A045），酸性茚三酮顯色法測定游離脯氨酸（Pro）質(zhì)量分?jǐn)?shù)。并采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel和IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱鍛煉對葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

葉片是植物發(fā)展進(jìn)化過程中對環(huán)境改變敏感且可塑性較大的器官，環(huán)境的變化常導(dǎo)致葉肉柵欄組織、海綿組織等解剖結(jié)構(gòu)的響應(yīng)與適應(yīng)。由圖1可以看出：在38℃熱脅迫下，相比未經(jīng)過熱鍛煉的植株，經(jīng)過熱鍛煉處理的植株柵欄組織細(xì)胞皺縮程度較輕，排列也較整齊；海綿組織則稍顯疏松。在42℃熱脅迫下，未經(jīng)熱鍛煉的植株葉片海綿組織皺縮嚴(yán)重，柵欄組織細(xì)胞皺縮，其柵狀排列幾不可見；經(jīng)熱鍛煉的植株葉片柵欄組織細(xì)胞皺縮但仍保持其柵狀排列，海綿組織結(jié)構(gòu)則嚴(yán)重破壞。結(jié)果表明，經(jīng)熱鍛煉預(yù)處理的 ‘狀元紅’植株葉片能在熱脅迫下較好地保持柵欄組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖1 各處理下 ‘狀元紅’葉片葉肉組織解剖結(jié)構(gòu)Figure 1 Mesophyll tissue anatomical structure of the leaves in ‘Zhuangyuan Hong’ under each treatment

柵欄海綿組織比是柵欄組織厚度與海綿組織厚度的比值，可用葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度與組織結(jié)構(gòu)疏松度的比值表示。葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度越大或組織結(jié)構(gòu)疏松度越小，柵海比越大。從表2可知，對照溫度下，經(jīng)熱鍛煉和未經(jīng)熱鍛煉處理對葉片柵海比無顯著影響。42℃時(shí)各處理葉片的柵海比與38℃時(shí)要低。而在同一熱脅迫下，熱鍛煉組柵海比比對照組要高，在38℃時(shí)高24.8%，42℃時(shí)高31.3%。檢測葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度發(fā)現(xiàn)，在對照溫度下，熱鍛煉處理后葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度顯著低于未經(jīng)鍛煉的葉片。38℃下熱鍛煉的葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度則有所增加，但差異不顯著。42℃時(shí)熱鍛煉處理的葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度比未經(jīng)鍛煉的葉片增加了13.0%，差異顯著。檢測葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度發(fā)現(xiàn)，對照溫度下，熱鍛煉對葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度沒有顯著差異。但當(dāng)溫度達(dá)到38℃和42℃時(shí)，熱鍛煉葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度值分別顯著低于未經(jīng)熱鍛煉的葉片。

2.2 熱鍛煉對葉片光合作用的影響

光合作用是植物對熱脅迫最為敏感的生理過程之一［15］。表3為熱鍛煉對 ‘狀元紅’葉片光合作用參數(shù)的影響。由表3可知：在對照溫度下，經(jīng)熱鍛煉的植株葉片凈光合速率（Pn）高于未經(jīng)鍛煉的葉片，表明此時(shí)植株光合作用受到影響，但差異不顯著；在同一熱激水平下，經(jīng)熱鍛煉的植株葉片凈光合速率均顯著高于未經(jīng)鍛煉的葉片。對照溫度下，經(jīng)熱鍛煉的葉氣孔導(dǎo)度（Gs）顯著高于未經(jīng)鍛煉的葉片；在38℃脅迫下經(jīng)熱鍛煉的葉片葉氣孔導(dǎo)度值低于未經(jīng)鍛煉的葉片；而在42℃脅迫下則是高于未經(jīng)熱鍛煉的葉片，但差異均不顯著。高溫脅迫時(shí)，經(jīng)熱鍛煉的植株葉片胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)（Ci）均低于未經(jīng)鍛煉的葉片，38℃下，兩者相差了25.5%，差異顯著。測定葉片蒸騰速率 （Ts）值發(fā)現(xiàn)，對照溫度下，經(jīng)熱鍛煉的葉片蒸騰速率值顯著高于未經(jīng)鍛煉的葉片；38℃下經(jīng)熱鍛煉的葉片蒸騰速率低于未經(jīng)鍛煉的葉片，42℃下則高于未經(jīng)鍛煉的葉片，但差異均不顯著。

表2 不同溫度下熱鍛煉對葉片葉肉組織結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of heat acclimation on mesophyll structure under different temperatures

表3 不同溫度下熱鍛煉對葉片光合參數(shù)的影響Table 3 Effects of heat acclimation on photosynthetic parameters under different temperatures

2.3 熱鍛煉對葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)的影響

高溫影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和活性氧積累，使得膜脂質(zhì)過氧化，加重膜損害。從表4可以看出，過氧化氫及MDA質(zhì)量摩爾濃度變化趨勢相同。在對照溫度下，熱鍛煉對過氧化氫及MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響不顯著。隨著熱脅迫程度的增加，過氧化氫及MDA質(zhì)量摩爾濃度均減少。在38℃時(shí)，相比于未經(jīng)鍛煉的葉片，經(jīng)熱鍛煉的葉片中過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度顯著降低，MDA質(zhì)量摩爾濃度變化則不顯著。在42℃時(shí)，過氧化氫與MDA質(zhì)量摩爾濃度變化均不顯著。

表4 不同溫度下熱鍛煉對葉片過氧化氫和MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響Table 4 Effects of heat acclimation on molality of H2O2and MDA under different temperatures

2.4 熱鍛煉對葉片滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響

熱脅迫下，植物通過細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)積累完成滲透調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)細(xì)胞水分環(huán)境的變化［13］。由表5可以看出：在對照溫度下，經(jīng)熱鍛煉的 ‘狀元紅’植株葉片可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于未經(jīng)鍛煉的植株葉片；隨著熱脅迫溫度上升，熱鍛煉組中所有可溶性物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于未經(jīng)鍛煉組。脅迫溫度達(dá)38℃時(shí)，熱鍛煉對可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響差異不明顯，對游離脯氨酸影響顯著；脅迫溫度達(dá)42℃時(shí)，熱鍛煉組葉片中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)均低于未鍛煉組，且差異顯著，但游離脯胺酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異仍不明顯。

2.5 熱鍛煉對葉片酶促抗氧化系統(tǒng)的影響

熱脅迫下，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的平衡被打破，活性氧積累。SOD,POD和CAT是植物體內(nèi)清除活性氧的重要保護(hù)酶［14］。對照溫度下，經(jīng)熱鍛煉的葉片中SOD活性高于未經(jīng)鍛煉的葉片；在38℃和42℃2個(gè)熱脅迫水平下，經(jīng)熱鍛煉的葉片SOD活性則低于未經(jīng)鍛煉的葉片，但差異并不明顯。POD及CAT活性與SOD變化趨勢相同，對照溫度下，經(jīng)熱鍛煉的葉片中POD及CAT活性均顯著低于未經(jīng)鍛煉的葉片；38℃高溫下，熱鍛煉組葉片POD及CAT活性均較低；42℃高溫下，熱鍛煉組葉片CAT活性較高但與未鍛煉組葉片差異并不顯著，而POD活性則高出約2.5倍，差異顯著。

表5 不同溫度下熱鍛煉對葉片可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 5 Effects of heat acclimation on mass fraction of soluble sugar,soluble protein and pro under different temperatures

3 討論

熱鍛煉能有效提高植株耐熱性，降低熱脅迫引起的傷害，如減緩高溫引起的葉片組織結(jié)構(gòu)損傷，減輕光合抑制，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性等［1,15-16］。本研究結(jié)果表明：經(jīng)30℃熱鍛煉后，杜鵑花品種‘狀元紅’在38℃和42℃熱脅迫下，耐熱性得到提高；表現(xiàn)為葉片組織結(jié)構(gòu)受損較輕，柵欄海綿組織比、組織結(jié)構(gòu)緊密度以及凈光合速率均有提高，過氧化氫、MDA質(zhì)量摩爾濃度和可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)及游離脯胺酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及SOD活性均下降。此外，熱鍛煉對POD及CAT活性也有影響。對杜鵑花而言，經(jīng)30℃熱鍛煉后，植株在38℃熱脅迫下耐熱性提高比較明顯，而在42℃下耐熱性變化不明顯。這與XU等［8］發(fā)現(xiàn)熱鍛煉對高羊茅Festuca arundinacea和多年生黑麥草Lolium perenne的影響研究結(jié)果相同，即即使經(jīng)過熱鍛煉，植株在經(jīng)受極端熱脅迫后（如42℃），耐熱性提高也不明顯。

表6 不同溫度下熱鍛煉對葉片SOD，POD和CAT活性的影響Table 6 Effects of heat acclimation on activity of SOD,POD and CAT under different temperatures

植物葉片的形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征最能體現(xiàn)植物對環(huán)境的適應(yīng)能力［16-17］。胡偉娟等［16］和申惠翡等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，耐熱性較高的植物種或品種柵海比和結(jié)構(gòu)緊密度較高。本研究可知，熱鍛煉后植株葉片柵海比和結(jié)構(gòu)緊密度均高于未鍛煉的植株。這可以在一定程度上表明，熱鍛煉處理后的杜鵑花植株耐熱性得到了提高。本研究還發(fā)現(xiàn)，熱鍛煉處理植株在2個(gè)應(yīng)試熱脅迫溫度下，植株葉肉組織結(jié)構(gòu)疏松度均低于未熱鍛煉的植株，與王鳳蘭等［18］的研究結(jié)果相同，即植株耐熱性較強(qiáng)時(shí)，疏松度反而較低，疏松度與耐熱性呈負(fù)相關(guān)。這主要是因?yàn)楹＞d組織厚度越大，即疏松度越高，越容易適應(yīng)濕生環(huán)境，而這種環(huán)境中的植物耐熱性往往較弱［17］。

光合作用是植物體內(nèi)對熱較敏感的生理過程之一。試驗(yàn)結(jié)果表明，熱鍛煉的植株葉片Pn在高溫脅迫下要高于未經(jīng)熱鍛煉的植株，表明熱鍛煉處理能減輕高溫脅迫引起的光合抑制。ZHAO等［15］發(fā)現(xiàn)鴨茅Dactylis glomerata在經(jīng)熱鍛煉處理后Pn要比未經(jīng)熱鍛煉的顯著增高，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同。關(guān)于熱脅迫對光合作用的抑制機(jī)制，早期研究認(rèn)為，主要?dú)w因于氣孔因素，即氣孔導(dǎo)度下降會降低植物與外界二氧化碳的交換，大大減少二氧化碳的供應(yīng)，造成光合作用原料供應(yīng)不足進(jìn)而引起凈光合速率的下降；同時(shí)氣孔導(dǎo)度下降降低蒸騰速率，減緩光合產(chǎn)物運(yùn)輸速率，進(jìn)而造成光合產(chǎn)物在葉綠體中不斷積累，間接制約凈光合速率［19］。也有研究表明：光合作用受到抑制主要與葉肉細(xì)胞自身活性（如胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)增加）有關(guān)［20］。在38℃高溫脅迫下，經(jīng)熱鍛煉的植株凈光合速率顯著上升，此時(shí)胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)顯著降低，提示熱鍛煉后凈光合速率的上升可能歸因于非氣孔因素。但在42℃熱脅迫下，熱鍛煉后的植株凈光合速率顯著上升時(shí)，胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)下降，氣孔導(dǎo)度和和蒸騰速率上升，且變化均不顯著，這表明凈光合速率的上升是氣孔及非氣孔因素共同作用的結(jié)果。

植物受到熱脅迫會促使過氧化氫積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜膜脂過氧化，膜熱穩(wěn)定性下降［8］。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，對細(xì)胞膜有毒害作用，其含量變化能反映細(xì)胞膜脂過氧化作用強(qiáng)弱和細(xì)胞的受損程度［14］。植物在受到逆境傷害后可通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓，對減輕高溫傷害有一定作用［21］。滲透物質(zhì)的積累也間接表明了細(xì)胞受到了損害，且在一定范圍內(nèi)積累物質(zhì)越多，細(xì)胞受損程度可能越大。XU等［8］在研究高羊茅和黑麥草時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一脅迫溫度下經(jīng)熱鍛煉的植株葉片過氧化氫和MDA的積累比未經(jīng)鍛煉的要低，說明熱鍛煉處理能減輕細(xì)胞膜脂過氧化程度。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熱鍛煉處理后，滲透物質(zhì)積累較少，這表明細(xì)胞受損程度較輕，植株耐熱性得到了提升。

對于在高溫逆境下細(xì)胞膜逐漸積累的活性氧，植物發(fā)展出2種抗氧化系統(tǒng)，酶清除系統(tǒng)和非酶清除系統(tǒng)。酶清除系統(tǒng)包括能夠?qū)⒊踝杂苫D(zhuǎn)化成過氧化氫的SOD和能夠觸發(fā)過氧化氫轉(zhuǎn)化成水和氧氣的CAT和POD［8］，本質(zhì)為通過控制胞內(nèi)活性氧含量來保護(hù)植物細(xì)胞。本研究中熱鍛煉后的植株葉片SOD活性得到了提高，與前人研究結(jié)果一致［8-9，11］；但在38℃高溫條件下，SOD，POD和CAT活性經(jīng)熱鍛煉的均低于未經(jīng)鍛煉的，這可能是因?yàn)樵谶@個(gè)溫度下，熱鍛煉后過氧化氫和MDA的積累量較少，并不需要高活性的酶分解過氧化氫及MDA；而在42℃高溫脅迫下，經(jīng)熱鍛煉的植株SOD活性低，POD和CAT活性較高，同時(shí)過氧化氫含量較低，這可能是因?yàn)镾OD受高溫影響較大使得活性較低，而POD和CAT這2種酶則能保持較高活性，因此積累的過氧化氫主要依靠這2種酶清除的。

本實(shí)驗(yàn)從解剖結(jié)構(gòu)、光合作用、生理生化特性等方面研究熱鍛煉對杜鵑花品種 ‘狀元紅’耐熱性的影響，證實(shí)了熱鍛煉處理能提高植株葉片光合作用，減輕葉片葉肉以及細(xì)胞的受損程度，一定程度上提高杜鵑花植株耐熱性。熱鍛煉處理對杜鵑花抵抗熱脅迫具有一定的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值，但其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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