穿膜肽標(biāo)記的熒光素酶蛋白在大腸桿菌中表達(dá)條件的優(yōu)化及其活性研究

余婷玉,方志遠(yuǎn),黃 衛(wèi),王淋荊,徐 寧

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405；2.中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院,廣東 廣州 510530；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部,廣東 廣州 510370)

熒光素酶(luciferase,LUC)是用于測(cè)定腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的靈敏、可靠的生物傳感器[1]。在有氧的條件下,ATP參與熒光素酶催化熒光素釋放熒光過(guò)程,并且釋放的熒光強(qiáng)度與ATP含量呈正相關(guān)。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的ATP檢測(cè),必不可少的細(xì)胞裂解后ATP提取過(guò)程會(huì)導(dǎo)致部分ATP水解[2],不利于高通量的藥物篩選。

因此為了快速精確檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP的含量,本實(shí)驗(yàn)研發(fā)了一種由穿膜肽和熒光素酶組成的嵌合蛋白(TAT-Luciferase,TAT-LUC)。細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)特指那些小于20個(gè)氨基酸、帶正電荷的短肽,可以穿過(guò)大多數(shù)細(xì)胞膜。它們可以將多種生物活性物質(zhì)攜帶入細(xì)胞中而無(wú)需特殊的培養(yǎng)環(huán)境,包括小分子化合物、染料、多肽、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、脂質(zhì)體、病毒等[3-7]。其中研究較多的是1988年發(fā)現(xiàn)由人類免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)基因編碼的一種被稱為反式轉(zhuǎn)錄激活因子(transactivator of transcription,TAT)的蛋白[8]。Fawell等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),與TAT共價(jià)結(jié)合的異源蛋白可被其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。本研究則利用TAT-LUC使熒光素酶在TAT的輔助下進(jìn)入細(xì)胞,可在不用裂解細(xì)胞的條件下對(duì)活細(xì)胞內(nèi)ATP濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。

為了得到大量有活性的TAT-LUC蛋白，可以采用比真核表達(dá)系統(tǒng)更為簡(jiǎn)單的大腸桿菌生產(chǎn)制備。其中影響蛋白原核表達(dá)的影響因素很多,包括宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)機(jī)、溫度和誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)濃度等。因此研究的重點(diǎn)是對(duì)該重組蛋白TAT-LUC的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)表達(dá)溫度和IPTG濃度等因素進(jìn)行優(yōu)化,以提高重組大腸桿菌周質(zhì)中可溶性TAT-LUC的表達(dá)量,并且將得到的TAT-LUC 與LUC進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)ATP,通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)分析TAT-LUC的敏感性和可靠性,為后期大規(guī)模的表達(dá)、純化和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

含穿膜肽標(biāo)記的熒光素酶基因的重組質(zhì)粒pET28a-TAT-LUC由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏，并成功轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素),IPTG(廣州杰特偉生物科技有限公司),D-蟲(chóng)熒光素鈉鹽(阿拉丁,上海),熒光素酶(Promega,美國(guó)),ATP(ATP二鈉鹽,Sigma),RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone,美國(guó)),雙抗(Hyclone,美國(guó)),胰酶(Gibco,美國(guó)),胎牛血清(四季青,中國(guó)),磷酸鹽緩沖液(PBS,Sigma,上海)。

2 方法

2.1 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)過(guò)夜后,按照1∶100比例接種于3 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃下210 r/min振蕩培養(yǎng)。首先,在37 ℃條件下培養(yǎng),當(dāng)菌液OD600分別達(dá)到0.15、0.4、0.6、0.9、1.4、2時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG;接著在22 ℃下繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)16 h以確定表達(dá)TAT-LUC的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)；然后在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)下添加終濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L的 IPTG,并分別在37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h和22 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h,分析37 ℃與22 ℃溫度下IPTG濃度對(duì)TAT-LUC表達(dá)量和活性的影響；最后在確定的最適溫度和 IPTG 濃度條件下,在培養(yǎng)前分別添加終濃度為10、20、30、40、50 mmol/L的 Mg2+,分析Mg2+濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量和菌體量的影響。

誘導(dǎo)表達(dá)后測(cè)每個(gè)樣品的OD600值,然后各收集菌液2 mL,10 000 r/min、4 ℃離心2 min,棄上清,菌體加入1 mL的PBS重懸,并進(jìn)行超聲破碎(工作3 s,間歇5 s,功率300 W,循環(huán)15次)；各取20 μL超聲后的全菌液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)；每個(gè)樣品另取100 μL誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液,加入終濃度為150 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)底物D-蟲(chóng)熒光素鈉鹽,混合均勻后立即放于96微孔板發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室,用含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基,在5%CO2、37 ℃下培養(yǎng)。

2.3 ATP檢測(cè)

重組蛋白TAT-LUC通過(guò)鎳柱(Ni-NTA)純化。對(duì)于無(wú)細(xì)胞的熒光素酶活性測(cè)定,使用無(wú)ATP水制備含有50 mg的D-蟲(chóng)熒光素鈉鹽和5 mmol/L MgCl2的熒光素底物溶液。在無(wú)ATP水中連續(xù)倍比稀釋ATP得到終濃度為10 μmol/L～10 nmol/L的ATP;將1 μL TAT-LUC(3.1 g/L)或1 μL LUC(0.5 g/L)加入到100 μL不同濃度的ATP溶液中混勻;最終加入終質(zhì)量濃度為150 μg/mL的底物D-蟲(chóng)熒光素鈉鹽,立即使用96微孔板光度計(jì)檢測(cè)熒光素酶活性。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)ATP含量的檢測(cè),首先將A549細(xì)胞倍比稀釋在黑壁96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中至每孔0至50 000個(gè);然后在100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1 μL的TAT-LUC或LUC孵育2 min;最后每孔添加D-蟲(chóng)熒光素鈉鹽至最終質(zhì)量濃度為150 mg/L,用96微孔板發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度反應(yīng)酶活性。

3 結(jié)果

3.1 不同誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)TAT-LUC表達(dá)量和活性的影響

從圖1(a)看出,加入誘導(dǎo)劑IPTG時(shí)的菌體濃度對(duì)質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白的影響較大。菌體濃度過(guò)低時(shí)誘導(dǎo)TAT-LUC表達(dá)量較低,過(guò)高時(shí)表達(dá)量反而降低。當(dāng)OD600為0.6～0.9時(shí)加入IPTG可獲得高表達(dá)量的TAT-LUC。其中OD600達(dá)到0.6時(shí)再誘導(dǎo),發(fā)光強(qiáng)度最高即TAT-LUC活性最強(qiáng),因此此時(shí)為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。OD600超過(guò)0.9再加IPTG誘導(dǎo),雖然菌體量變化不大,但發(fā)光強(qiáng)度明顯降低(見(jiàn)圖2(a))。

由圖1(b)可知，37 ℃下終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h后,目的蛋白表達(dá)量最高。IPTG濃度過(guò)低不利于目的蛋白表達(dá),而濃度過(guò)高目的蛋白表達(dá)量基本沒(méi)變化。37 ℃下IPTG濃度過(guò)高會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)造成毒害作用,使菌體量下降，同時(shí)TAT-LUC活性明顯下降(見(jiàn)圖2(b))。同樣在22℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)16 h,0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)量最高(見(jiàn)圖1(c))活性最強(qiáng)(見(jiàn)圖2(c)),IPTG濃度過(guò)高時(shí)則菌體量、目的蛋白表達(dá)量和活性基本沒(méi)變化,由此可以判斷最佳誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5 mmol/L。由圖1(d)可知,添加Mg2+濃度在20～50 mmol/L的時(shí)對(duì)目的蛋白表達(dá)量是有促進(jìn)作用的。Mg2+的濃度對(duì)菌體量影響不大,但隨著Mg2+的濃度的增加酶活性逐漸增加(見(jiàn)圖2(d))。

3.2 ATP檢測(cè)

對(duì)于細(xì)胞外ATP檢測(cè),通過(guò)比較TAT-LUC和LUC之間的發(fā)光強(qiáng)度說(shuō)明TAT的標(biāo)記導(dǎo)致在所測(cè)試的整個(gè)濃度范圍內(nèi)TAT-LUC相對(duì)LUC對(duì)ATP反應(yīng)的敏感性有所降低。然而,TAT-LUC的靈敏度仍然可以檢測(cè)10 nmol/L ATP(見(jiàn)圖3(a))。此外,與LUC的可靠性(R2=0.993)相比，TAT-LUC的酶活性與ATP濃度之間有很強(qiáng)的相關(guān)性(R2=0.994)。

對(duì)于細(xì)胞內(nèi)ATP檢測(cè),將LUC處理后和TAT-LUC處理后的不同細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行了對(duì)比。TAT-LUC的發(fā)光強(qiáng)度在100個(gè)A549細(xì)胞中是LUC的14.46倍,并且TAT-LUC可以測(cè)量至少50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)發(fā)光。細(xì)胞內(nèi)ATP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)之間存在強(qiáng)相關(guān)性(見(jiàn)圖3(b),R2=0.997)。相比之下,用LUC處理后不同細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著相關(guān)性(R2=0.707),發(fā)光強(qiáng)度也明顯低于TAT-LUC。

4 討論

熒光素酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP時(shí),細(xì)胞裂解后ATP的提取過(guò)程不可避免,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP測(cè)量不準(zhǔn)確。因此研發(fā)了一種不用裂解細(xì)胞的穿膜肽標(biāo)記的熒光素酶蛋白(TAT-LUC),為了更快速并精確地檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的ATP含量。本研究在前期構(gòu)建的穿膜肽標(biāo)記的熒光素酶基因重組質(zhì)粒pET28a-TAT-LUC的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化做了初步研究,以期能夠得到更高的酶活,為后期腫瘤藥敏快速檢測(cè)研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 SDS-PAGE分析不同誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)TAT-LUC表達(dá)量的影響

圖2 不同誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)菌體量和TAT-LUC活性的影響

圖3 ATP檢測(cè)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,對(duì)目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在含Mg2+濃度為50 mmol/L的LB培養(yǎng)基中將大腸桿菌培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,22 ℃誘導(dǎo)16 h可獲得大量高活性的TAT-LUC。取誘導(dǎo)表達(dá)TAT-LUC的菌液,加入底物后可直接測(cè)大腸桿菌表達(dá)的目的蛋白的活性。其中在37 ℃下誘導(dǎo)雖然TAT-LUC表達(dá)量高，但由于在短時(shí)間內(nèi)快速的蛋白合成使產(chǎn)物大量堆積,以致于沒(méi)用足夠的時(shí)間進(jìn)行正確的折疊和二硫鍵配對(duì),形成包涵體沉淀,因此蛋白活性不高,需要進(jìn)行復(fù)雜的蛋白復(fù)性過(guò)程[10-11]。22 ℃低溫過(guò)夜培養(yǎng)下的可溶表達(dá)雖蛋白表達(dá)量低,但TAT-LUC酶活性高,說(shuō)明低溫長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)有利于酶的高活性表達(dá)。另外,熒光素酶在催化反應(yīng)中會(huì)將Mg-ATP復(fù)合物和底物熒光素的腺苷酸化,然后該腺苷酸的氧化反應(yīng)以電子激發(fā)狀態(tài)形成光發(fā)射體的氧化熒光素[12]。并且有研究表明,Mg2+、Mn2+、Ca2+都能夠在很大的濃度范圍內(nèi)提高熒光素酶的活性,并且前兩者的作用效能基本相同,后者的效果能達(dá)到前兩者的 60%左右[13]。因此Mg2+作為熒光素酶發(fā)光反應(yīng)的必需離子,對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶活性有一定的影響,在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中有必要添加。

相比LUC,TAT-LUC可以檢測(cè)到小于10 nmol/L的ATP,發(fā)光強(qiáng)度與ATP含量呈強(qiáng)相關(guān)性(R2=0.994),表明TAT的標(biāo)記不影響熒光素酶與ATP反應(yīng)的可靠性。由于ATP普遍存在于一切活細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞死亡后細(xì)胞內(nèi)ATP迅速水解,而活細(xì)胞的ATP含量基本固定,因此所測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度能夠反映出活細(xì)胞的數(shù)量。不進(jìn)行細(xì)胞裂解,TAT-LUC至少可以檢測(cè)40個(gè)細(xì)胞內(nèi)的ATP,發(fā)光強(qiáng)度與ATP含量同樣呈強(qiáng)相關(guān)性(R2=0.997)。結(jié)果與對(duì)細(xì)胞裂解提取ATP的許多報(bào)道一致,表明ATP生物發(fā)光的強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)成正比[14]。與TAT-LUC相比,對(duì)照的LUC細(xì)胞內(nèi)低敏感性顯然是由于細(xì)胞不能對(duì)其攝取所導(dǎo)致的?？傮w來(lái)說(shuō),雖然TAT標(biāo)記降低了細(xì)胞外ATP檢測(cè)的靈敏度,但它顯著提高了細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的靈敏度和可靠性,突顯了TAT-LUC在活細(xì)胞內(nèi)ATP測(cè)量中的應(yīng)用,為實(shí)時(shí)進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)研究及細(xì)胞毒性測(cè)定提供了一種新的檢測(cè)方法。該方法無(wú)需裂解細(xì)胞提取ATP,避免了ATP提取過(guò)程中的降解及操作誤差上的損失,能更加準(zhǔn)確的測(cè)定活細(xì)胞內(nèi)的ATP含量,實(shí)時(shí)進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)研究及細(xì)胞毒性測(cè)定。

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