磁性熒光納米球的制備及其對(duì)細(xì)胞的識(shí)別和捕獲

溫聰穎,杜正坤,吳玲玲

(1.中國石油大學(xué)(華東) 理學(xué)院,山東 青島 266580； 2.武漢大學(xué) 教育部生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430072)

21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì),生物化學(xué)對(duì)社會(huì)的發(fā)展起著重要的作用[1-2],生物化學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)學(xué)院、化學(xué)院、醫(yī)學(xué)院等開設(shè)的重要專業(yè)課程,其中實(shí)驗(yàn)教學(xué)在學(xué)生理解和掌握生物化學(xué)知識(shí)以及對(duì)學(xué)生的創(chuàng)新能力培養(yǎng)方面起著舉足輕重的作用[3-5]。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)是學(xué)生按照教科書提供的實(shí)驗(yàn)方案,在教師的指導(dǎo)下完成實(shí)驗(yàn),有助于培養(yǎng)學(xué)生的基本實(shí)驗(yàn)技能，但實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與科研前沿聯(lián)系較少,學(xué)生的創(chuàng)新實(shí)踐能力和綜合能力不能得到很好的鍛煉[5-6]。生物化學(xué)是一門前沿性學(xué)科,為了加強(qiáng)學(xué)生掌握前沿知識(shí)和從事科學(xué)研究能力的培養(yǎng),通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)向?qū)W生展示生物化學(xué)的前沿進(jìn)展已經(jīng)成為緊迫而艱巨的任務(wù)[6-7]。

1 量子點(diǎn)和磁性納米顆粒簡介

隨著納米科技的迅速發(fā)展,越來越多的納米材料應(yīng)用于生物化學(xué)研究,基于量子點(diǎn)和磁性納米顆粒的功能材料展現(xiàn)出傳統(tǒng)材料所無法比擬的優(yōu)良性質(zhì)[8-10]。量子點(diǎn)是尺寸接近或小于激子波爾半徑的半導(dǎo)體納米晶,主要由II-VI族元素或者III-V族元素組成,是一種新型的熒光材料,具有寬激發(fā)窄發(fā)射、一元激發(fā)多元發(fā)射、發(fā)射波長隨尺寸和組成可調(diào)、熒光強(qiáng)、耐光漂等特點(diǎn),已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物檢測(cè)、生物成像、動(dòng)態(tài)示蹤等領(lǐng)域[11-13]。磁性納米顆粒指的是含鐵、鉑、鈷或者它們的合金及其氧化物的納米材料,當(dāng)其尺寸小于某一臨界值時(shí),它們?cè)诔叵戮途邆淞顺槾判?即它們具有較大磁化率而矯頑力幾乎為零,宏觀上來看,超順磁性納米顆粒在磁場下表現(xiàn)出很強(qiáng)的磁性,撤掉磁場則迅速失去磁性,而不會(huì)發(fā)生團(tuán)聚,從而使它們操縱起來特別方便,基于磁性納米顆粒的磁分選技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[14-17]。

鑒于基于量子點(diǎn)和磁性納米顆粒的功能材料在生物化學(xué)研究中極高的應(yīng)用價(jià)值和非常廣闊的應(yīng)用前景,作為相關(guān)專業(yè)的大學(xué)生,非常有必要了解這方面的前沿知識(shí)?；诖?在大量教學(xué)和科學(xué)研究的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了“磁性熒光納米球的制備及其對(duì)細(xì)胞的識(shí)別和捕獲”綜合研究型實(shí)驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)通過將磁性納米顆粒和量子點(diǎn)包埋進(jìn)高分子球內(nèi)部制得磁性熒光納米球,進(jìn)一步通過生物修飾在納米球表面引入能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的靶向分子,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和捕獲。整個(gè)實(shí)驗(yàn)涉及到化學(xué)制備、生物偶聯(lián)、識(shí)別捕獲等操作,熒光、磁性、形貌等表征技術(shù),以及生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中常見儀器的使用。既能夠全面培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能,又能向?qū)W生展示納米材料在生物化學(xué)中最新進(jìn)展,具有綜合性、新穎性、前瞻性而且操作容易,非常適合作為生物化學(xué)的綜合研究型實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)原理

根據(jù)相似相容原理,油溶性的量子點(diǎn)和磁性納米顆粒表面為疏水配體、可以進(jìn)入具有疏水空腔的高分子球內(nèi)部,從而將納米顆粒包埋到納米球內(nèi)部。此即為制備熒光磁性球的最重要的一種方法——溶脹包埋法(其他3種主要方法分別為聚合包埋法、組裝法和原位合成法)[9]。該法操作簡便,直接使用油相納米粒子且?guī)缀醪黄茐募{米粒子表面的配體結(jié)構(gòu),因而最大限度地保持了納米粒子的光學(xué)和磁學(xué)性能。本實(shí)驗(yàn)選用無乳聚合法合成的苯乙烯-丙烯酰胺共聚高分子球,其外部具有親水基團(tuán),內(nèi)部為疏水碳鏈結(jié)構(gòu),在溶脹劑的作用下能夠產(chǎn)生疏水空腔,通過超聲油溶性的量子點(diǎn)和磁性納米顆粒就可以通過疏水相互作用進(jìn)入疏水空腔中，然后將納米球從溶脹劑轉(zhuǎn)移至水相,納米球體積迅速縮小復(fù)原,從而將納米顆粒禁錮在納米球內(nèi)部,制得磁性熒光納米球(MFNs)[18-19]。

進(jìn)一步通過共價(jià)偶聯(lián),在磁性熒光納米球表面修飾具有特異靶向性的生物分子,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)選用乳腺癌SK-Br-3細(xì)胞為目標(biāo)物,靶向分子選用抗上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)抗體,SK-Br-3細(xì)胞表面存在大量的EpCAM,因此兩者可以通過抗體抗原的作用實(shí)現(xiàn)結(jié)合。在實(shí)驗(yàn)中,利用“Carbodiimide chemistry”[20]將納米球表面的羧基與抗體上的氨基偶聯(lián),制得對(duì)SK-Br-3細(xì)胞靶向的磁性熒光納米球,將其投入到含有SK-Br-3細(xì)胞的樣品中,即可利用納米球表面抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原的親和作用完成對(duì)SK-Br-3細(xì)胞識(shí)別和捕獲。圖1為磁性熒光納米球的制備、生物修飾及其捕獲腫瘤細(xì)胞示意圖。

圖1 磁性熒光納米球的制備、生物修飾及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的捕獲示意圖

3 實(shí)驗(yàn)進(jìn)度安排

如圖2所示，開放性實(shí)驗(yàn)的教學(xué)過程分為3個(gè)階段,即實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)執(zhí)行和實(shí)驗(yàn)拓展。該實(shí)驗(yàn)需要較好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),建議在已經(jīng)掌握一定實(shí)驗(yàn)技能的大三學(xué)生中開展。

圖2 實(shí)驗(yàn)進(jìn)度安排

4 實(shí)驗(yàn)

4.1 試劑與儀器

試劑:羧基化的苯乙烯-丙烯酰胺共聚高分子球,油溶性紅色CdSe/ZnS 量子點(diǎn),油溶性Fe3O4磁性納米顆粒,正丁醇,氯仿,乙醇,抗EpCAM抗體,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),pH 6.8、0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 6.8 PBS),pH 7.2、0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 7.2 PBS),磷酸鹽平衡生理鹽水(1×PBS),乳腺癌SK-Br-3細(xì)胞(濃度約為1×106個(gè)/mL,分散于1×PBS中)。

儀器:超聲波清洗器,離心機(jī),磁力架,暗箱紫外分析儀,恒溫振蕩器,分析天平,熒光倒置顯微鏡,透射電鏡。

4.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.2.1 MFNs的制備

取1.5 mL高分子球懸液于2 mL離心管中,離心(16 000 r/min，30 min)得高分子球沉淀,晾置5 min;取溶于正己烷的磁性納米顆粒300 μL和量子點(diǎn)500 μL,加入3倍體積乙醇,離心(12 000 r/min，3 min)得到磁性納米顆粒和量子點(diǎn)的沉淀;用600 μL溶脹劑(氯仿和正丁醇的混合溶液,兩者體積比為5∶95)超聲分散上述納米顆粒沉淀;然后加入晾置的高分子球沉淀中,繼續(xù)超聲30 min;通過離心(12 000 r/min，5 min)得沉淀,用乙醇洗滌沉淀2次;最后向納米球沉淀中加入1 mL超純水,超聲1 h;靜置過夜取上清,即得MFNs。

4.2.2 MFNs的表征

形貌表征:分別取10 μL未包埋納米顆粒的高分子球的稀釋液以及制得的MFNs的稀釋液滴到碳支持膜上,放置過夜晾干。通過透射電鏡觀察并拍照。

磁性表征:將裝有MFNs懸液的離心管緊貼磁力架,每隔20 s拍照,觀察磁響應(yīng)情況。

熒光表征:將裝有MFNs懸液的離心管置于暗箱紫外分析儀中,打開紫外燈,觀察MFNs的發(fā)光情況并拍照；取3 μL MFNs滴至載玻片上,蓋上蓋玻片,置于熒光倒置顯微鏡上,選取紫外激發(fā)光,用100×油鏡進(jìn)行觀察并拍照。

4.2.3 MFNs的生物功能化

取200 μL MFNs,用pH 6.8 PBS通過磁分選洗滌2次,分散到400 μL、pH 6.8 PBS中,超聲均勻,加入分別用200 μL、pH 6.8 PBS溶解的EDC(8 mg)和NHS(4 mg)；混勻后置于恒溫振蕩器上150 r/min室溫下反應(yīng)30 min;將產(chǎn)物用pH 7.2 PBS洗滌3次,分散到800 μL、pH 7.2 PBS中,加入40 μg抗EpCAM抗體,置于恒溫振蕩器上150 r/min室溫下反應(yīng)4 h；將產(chǎn)物用pH 7.2 PBS洗滌5次,除去未反應(yīng)的分子,分散于200 μL 1×PBS中,即得偶聯(lián)了抗EpCAM抗體的磁性熒光納米球(MFNs-anti-EpCAM),存于4°C冰箱待用。

4.2.4 MFNs-anti-EpCAM用于腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和捕獲

分別進(jìn)行以下2個(gè)實(shí)驗(yàn):(1)取100 μL SK-Br-3細(xì)胞懸液到入1.5 mL離心管中,補(bǔ)充1×PBS 900 μL,加入10 μL MFNs-anti-EpCAM；(2)取100 μL SK-Br-3細(xì)胞懸液到入1.5 mL離心管中,補(bǔ)充1×PBS 900 μL,加入10 μL未進(jìn)行生物修飾的MFNs。將上述兩支離心管置于恒溫振蕩器上,37°C下輕搖孵育30 min,磁分選并洗滌,收集捕獲產(chǎn)物并用熒光顯微鏡觀察。

4.3 結(jié)果與討論

4.3.1 MFNs的性能研究

圖3為未包埋納米顆粒的高分子球和包埋了納米顆粒的MFNs透射電鏡圖。學(xué)生可以很清楚地觀察到:相比于原球,制得的MFNs內(nèi)部存在襯度更大的小顆粒,MFNs的尺寸相比于原球幾乎沒有變化且表面相對(duì)平滑,從而非常直觀地證明納米顆粒進(jìn)入了高分子球內(nèi)部。學(xué)生通過將MFNs懸液用磁鐵吸引不同的時(shí)間觀察MFNs被吸引的情況表征了MFNs磁響應(yīng)速度(見圖4),可以看出隨著吸引時(shí)間的延長,MFNs被逐漸吸引到靠近磁鐵一邊的管壁上,大約80 s后,幾乎所有的MFNs都能被磁鐵捕獲,說明MFNs具有較快的磁響應(yīng),通過磁鐵即可很方便地進(jìn)行操縱。

裝有MFNs懸液的離心管置于暗箱紫外分析儀中觀察MFNs的發(fā)光情況如圖5(a)所示,可以看到明顯的紅色熒光信號(hào)。圖5(b)顯示了熒光顯微鏡下觀察到的單顆磁性熒光納米球的發(fā)光情況,可以看出MFNs的熒光很強(qiáng),且具有良好的分散性。以上表征表明量子點(diǎn)和磁性納米顆粒被成功地包埋進(jìn)高分子球內(nèi)部,制得的MFNs具有快速的磁響應(yīng)以及優(yōu)良的熒光性能。

圖4 MFNs懸液在磁力架(磁鐵)吸引不同時(shí)間下的照片

圖5 MFNs懸液在紫外光照射下的照片和MFNs的熒光顯微鏡圖片

4.3.2 MFNs-anti-EpCAM對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和捕獲效果研究

將MFNs-anti-EpCAM、MFNs與SK-Br-3細(xì)胞作用后磁分選的產(chǎn)物用熒光顯微鏡觀察。圖6為MFNs-anti-EpCAM捕獲SK-Br-3細(xì)胞的明場和對(duì)應(yīng)的熒光場圖片,可以看出存在大量的呈球形或橢球型的細(xì)胞,而且在紫外光激發(fā)下,細(xì)胞表面有很強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)。圖7是MFNs捕獲SK-Br-3細(xì)胞的明場和對(duì)應(yīng)的熒光場圖片,幾乎沒有觀察到細(xì)胞,只能觀察到呈單分散狀態(tài)的磁性熒光納米球。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MFNs-anti-EpCAM能夠識(shí)別和結(jié)合SK-Br-3細(xì)胞,進(jìn)一步通過磁分選完成對(duì)細(xì)胞的捕獲,而未修飾抗體的MFNs幾乎不能夠識(shí)別和捕獲SK-Br-3細(xì)胞。學(xué)生分析為:EpCAM表達(dá)于SK-Br-3細(xì)胞表面,抗EpCAM抗體可以通過抗原抗體作用與SK-Br-3細(xì)胞結(jié)合。MFNs-anti-EpCAM連有抗體,故能夠和SK-Br-3細(xì)胞結(jié)合,從而很好地識(shí)別和捕獲SK-Br-3細(xì)胞,而未進(jìn)行生物修飾的MFNs由于表面不存在可以和細(xì)胞結(jié)合的分子,所以不能識(shí)別和捕獲SK-Br-3細(xì)胞。

圖6 MFNs-anti-EpCAM分選SK-Br-3細(xì)胞捕獲產(chǎn)物的顯微鏡明場圖片和對(duì)應(yīng)的熒光場圖片

圖7 MFNs分選SK-Br-3細(xì)胞捕獲產(chǎn)物的顯微鏡明場圖片和對(duì)應(yīng)的熒光場圖片

5 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)將磁性納米顆粒和量子點(diǎn)包埋進(jìn)高分子球內(nèi)部制得了具有快速磁響應(yīng)以及優(yōu)良熒光性能的磁性熒光納米球,通過生物修飾在納米球表面引入能夠和腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的生物分子,從而成功實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和捕獲。該實(shí)驗(yàn)將材料合成、表征、修飾、應(yīng)用形成一套完整的科研訓(xùn)練過程,培養(yǎng)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能、科研素養(yǎng)和創(chuàng)新精神。該實(shí)驗(yàn)涉及到量子點(diǎn)、磁性納米顆粒等熱門納米材料的性質(zhì)和應(yīng)用,有助于學(xué)生了解科研前沿進(jìn)展以及科學(xué)研究的魅力,從而激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性以及從事科學(xué)研究的興趣。該實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行如下兩方面拓展：(1)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)用MFNs識(shí)別和捕獲其他生物對(duì)象,如其他腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌、蛋白質(zhì)、DNA等；(2)從量子點(diǎn)的一元激發(fā)多元發(fā)射出發(fā),設(shè)計(jì)同時(shí)識(shí)別和捕獲多種生物對(duì)象的方案。

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