杏鮑菇培養(yǎng)基發(fā)酵前后的理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究

戎念杭,羅小芳,歐陽超,張 星,曾 彭,栗海波,張 永,沈凡超,覃佐東,

(1.浙江大學(xué) 分析測試中心,浙江 杭州 310058；2.湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南 永州 425199； 3.湖南省宇秀生物科技有限公司,湖南 永州 425000)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)隸屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是一種名貴珍稀食用菌,富含多糖、膳食纖維、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及多種礦物質(zhì)元素,具有抗腫瘤、降血壓及潤腸道等功效,是一種營養(yǎng)保健價值極高的食用菌[1]，已成為我國又一重要食用菌。根據(jù)產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)統(tǒng)計(jì),杏鮑菇產(chǎn)量近5年內(nèi)以超過10%的增長率持續(xù)增長,2015年中國杏鮑菇產(chǎn)量達(dá)到110萬噸,產(chǎn)值達(dá)65億元,占同期國內(nèi)食用菌總產(chǎn)量的3.1%[2]。

由于杏鮑菇的生長周期較短,生物轉(zhuǎn)化效率低,不能充分地利用培養(yǎng)料的營養(yǎng)成分,導(dǎo)致菌糠中富含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、菌絲體及經(jīng)菌絲體生物轉(zhuǎn)化生成的糖類、有機(jī)酸和生物活性物質(zhì)等[3],這與平菇對營養(yǎng)物質(zhì)的需求極為相似,可作為栽培平菇的原料。另外，其表面豐富的羥基、羰基、羧基、酰胺基、磷酸基等還可以螯合廢水中的金屬陽離子[4]。本文對杏鮑菇培養(yǎng)基發(fā)酵前后的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,為杏鮑菇培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化以及菌糠的二次利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與試劑

原料:杏鮑菇，原始的未經(jīng)過發(fā)酵處理的杏鮑菇培養(yǎng)基(湖南省宇秀生物科技有限公司)，培養(yǎng)杏鮑菇29 d后菌糠(發(fā)酵培養(yǎng)后的菌糠)。

試劑:溴化鉀,硫酸銅,無水氯化鈣,濃鹽酸,濃硝酸,氫氟酸,高氯酸，都為分析純，天津市福是化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

主要儀器:HNY—200D恒溫培養(yǎng)振蕩器，TDD5M長沙平凡儀器儀表有限公司離心機(jī)，UV—2800型紫外分光光度計(jì)，PerkinElmer NexIon 300X 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，Dionex ICS-2000 離子色譜儀，傅里葉變換紅外光譜儀(AVATAR 370 FT-IR，Thermo Nicolet公司)，微波消解儀(Multiwave PRO，Anton Paar公司)，場發(fā)射掃描電鏡(SU8010，日本HITACHI公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

通過對杏鮑菇培養(yǎng)基發(fā)酵前后進(jìn)行離子色譜分析、紅外吸收光譜分析、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀分析、掃描電子顯微鏡及X射線能譜分析,對發(fā)酵前與發(fā)酵后菌糠的化學(xué)成分、分子結(jié)構(gòu)與化學(xué)鍵及表面的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,為杏鮑菇培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化提供可靠的理論基礎(chǔ)。

2.1 杏鮑菇培養(yǎng)基發(fā)酵前后的掃描電鏡觀察

隨機(jī)取發(fā)酵前后的杏鮑菇培養(yǎng)基樣品各0.5 g左右,均勻鋪撒在粘有碳導(dǎo)電膠、直徑為50.8 mm(2英寸)的掃描電鏡樣品臺上,在離子濺射儀中噴涂鉑金(Pt)60 s后,將樣品置于場發(fā)射掃描電鏡中,在加速電壓3 kV、工作距離10 mm,放大倍數(shù)80～3 500倍下觀察[5]。

2.2 發(fā)酵前后杏鮑菇培養(yǎng)基的紅外光譜檢測

隨機(jī)各取0.5 g左右的發(fā)酵前后杏鮑菇培養(yǎng)基樣品，分別與100.0 mg溴化鉀混勻,在研缽中研勻至200目,移入壓模機(jī)內(nèi)壓制成直徑13 mm的錠片,迅速放入傅里葉變換紅外光譜儀(AVATAR 370 FT-IR;Thermo Nicolet公司)進(jìn)行檢測分析,波數(shù)為400～4 000 cm-1。

2.3 發(fā)酵前后杏鮑菇培養(yǎng)基的陰陽離子測定

將發(fā)酵前后杏鮑菇培養(yǎng)基樣品磨碎,用20目篩子過篩,準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g,將其放在洗凈的坩堝中,用去離子水將樣品濕潤,加入5 mL濃鹽酸于聚四氟乙烯坩堝中,蓋上蓋,放置電熱板上(控制電熱板溫度在 200 ℃)消解至無酸；加入5.0 mL濃硝酸和2.0 mL濃高氯酸,放置電熱板上加熱至有白色晶體產(chǎn)生(若消解未完全則繼續(xù)按照5∶2的比例加入濃硝酸和濃高氯酸,直至白色晶體產(chǎn)生)；消解完全后,揭開蓋,去除酸(白色霧氣冒出位置),將白色晶體用1.0%的稀硝酸轉(zhuǎn)移至50.0 m L的容量瓶中定容[4],用定性濾紙將容量瓶中的液體過濾,即制成消解液；將消解后的樣品,吸取25.0 μL放在ICS-1500型離子色譜儀中進(jìn)行分析[6]。

2.4 發(fā)酵前后杏鮑菇培養(yǎng)基的重金屬含量測定

隨機(jī)取發(fā)酵前后杏鮑菇培養(yǎng)基樣品0.2 g,加入7.0 mL HNO3,在110 ℃條件下預(yù)處理30 min后放入微波消解儀；600 W中升溫5 min,600 W中平衡5 min,1 000 W中升溫10 min,1 000 W中平衡15 min;取出后再在110 ℃條件下加酸至1～2 mL,用水定容至50.0 mL;過濾后放入NexIon 300X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)樣器中檢測。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 掃描電鏡(SEM)及能譜元素分析

對發(fā)酵前后杏鮑菇培養(yǎng)基進(jìn)行掃描電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后杏鮑菇培養(yǎng)基主要由木屑、菌絲體、木材提取物及少量灰分等組成,其表面相比于發(fā)酵前培養(yǎng)基更加粗糙,這主要與木屑中纖維素與半纖維素的結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)。在這些被破壞的纖維絲之間存在諸多微小空隙,通過水溶液中的振蕩,可觀察到更多的木質(zhì)片層碎片和內(nèi)部填充物溶出[7]。在放大倍數(shù)為80、100、150、500時,結(jié)果見圖1。

從圖1中可以看出,未經(jīng)發(fā)酵的培養(yǎng)基由于沒有杏鮑菇酶的降解,培養(yǎng)基質(zhì)的表觀結(jié)構(gòu)緊密、規(guī)整(見圖1(a))，而發(fā)酵后的培養(yǎng)基表面呈現(xiàn)不規(guī)則的褶皺結(jié)構(gòu),這是主要是由于杏鮑菇菌絲體在生長過程中,分泌出某種激素物質(zhì)和特殊的酶,使培養(yǎng)基中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等有機(jī)物質(zhì)分解[8]；從圖1(c)中,能清晰地發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的培養(yǎng)基表面被酶解,其表面吸附面積大大提升;圖1(d)中明顯變得粗糙、質(zhì)地相對緊密,且具有許多微觀孔洞、溝壑和褶皺,這主要是因?yàn)榻?jīng)過發(fā)酵后的培養(yǎng)基表面被腐殖化,培養(yǎng)基中的纖維結(jié)構(gòu)被菌絲體分泌的酶系穿透、降解,遭到了嚴(yán)重的破壞,產(chǎn)生出很多的裂縫和空洞。經(jīng)過對比分析可以發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后的培養(yǎng)基其表面積得到很大程度的提升,比發(fā)酵前的培養(yǎng)基具有更強(qiáng)的吸附性能,這為菌糠作為土壤基質(zhì)、有機(jī)肥料等原料提供了更可行、安全的論證。

利用能譜儀在每個樣品表面隨機(jī)抽取3點(diǎn)做元素的能譜分析,得到樣品表面各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。從表1中可以看出，發(fā)酵后培養(yǎng)基較發(fā)酵前培養(yǎng)基中的碳百分?jǐn)?shù)含量降低4.84。碳作為培養(yǎng)基組成的主要成分之一,其主要功能有2個:一是為微生物細(xì)胞提供炭素和碳架；二是為微生物生命活動提供能源,杏鮑菇既可以利用成分復(fù)雜的復(fù)合碳源,又可以利用單糖和雙糖等小分子碳源[9],但利用復(fù)合碳源的效果明顯低于小分子碳源。另外，杏鮑菇在生長過程中對Mg、P、K元素也表現(xiàn)出不同的吸收,其中杏鮑菇對K元素的吸收最為明顯,這主要與對磷酸二氫鉀的利用率有關(guān)。郭智等[10]在對杏鮑菇培養(yǎng)基做優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),磷酸二氫鉀可作為無機(jī)鹽促進(jìn)杏鮑菇菌絲的生長,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時促進(jìn)效果尤為明顯,Mg元素主要以硫酸鎂的形式促進(jìn)杏鮑菇生長,對比發(fā)酵前后Mg元素含量變化不明顯。

表1 杏鮑菇培養(yǎng)基發(fā)酵前后的能譜元素分析

表中數(shù)據(jù):平均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差

3.2 紅外光譜分析

圖2為發(fā)酵前后的紅外光譜圖,經(jīng)過對比可知:發(fā)酵后1 645 cm-1處吸收峰和發(fā)酵前1 652 cm-1處吸收峰對應(yīng)為醇羥基(呈現(xiàn)彎曲振動)[11]；發(fā)酵后1 645 cm-1處吸收峰相對比例增加；發(fā)酵前菌糠與發(fā)酵后菌糠在3 300～3 650 cm-1區(qū)域均有吸收峰,該峰對應(yīng)的官能基團(tuán)為締合態(tài)羥基,發(fā)酵后該區(qū)域吸收峰的寬度比發(fā)酵前更寬,可能是由于杏鮑菇生長過程中產(chǎn)生的漆酶將木質(zhì)素分解[11],導(dǎo)致木質(zhì)素中的酚羥基暴露出來。有關(guān)研究表明,從多種新鮮食用菌子實(shí)體中提取漆酶,發(fā)現(xiàn)杏鮑菇漆酶的酶活性最高,其酶學(xué)性質(zhì)的研究對今后漆酶的應(yīng)用提供有價值的理論數(shù)據(jù)[9]。發(fā)酵后1 055 cm-1處吸收峰和發(fā)酵前1 051 cm-1處吸收峰對應(yīng)木質(zhì)素中的醚基C—O—C,且呈現(xiàn)伸縮振動[11],而發(fā)酵后在該區(qū)域的吸收峰相對比例減少,與發(fā)酵過程醚水解過程相符,進(jìn)一步說明在發(fā)酵過程部分木質(zhì)素被分解。發(fā)酵前有β-纖維素特征吸收峰在1 424 cm-1,發(fā)酵后消失,說明β-纖維素結(jié)構(gòu)被分解,與上述分析一致。發(fā)酵后1 323 cm-1相對比例增加,該峰對應(yīng)O—H彎曲振動[11],說明O—H相對比例增加,與木質(zhì)纖維素被水解有關(guān)。上述的發(fā)酵后3 405 cm-1處寬峰(O—H伸縮振動)比發(fā)酵前變寬也與醇羥基相對比例有關(guān)。因而可以解釋:由于發(fā)酵后醇羥基相對比例增加,導(dǎo)致發(fā)酵后吸附水比例相應(yīng)增加。

3.3 培養(yǎng)基的陰陽離子分析與優(yōu)化

ICS-1500型離子色譜儀分析結(jié)果見表2。

圖2 杏鮑菇培養(yǎng)基發(fā)酵前后的紅外光譜分析

表2 發(fā)酵前后杏鮑菇培養(yǎng)基陽離子和陰離子含量

在杏鮑菇液體培養(yǎng)基優(yōu)化研究中表明,在杏鮑菇培養(yǎng)基中加入磷酸二氫鉀能有效提高菌絲得率和胞外多糖得率。李志濤等[14]研究發(fā)現(xiàn),杏鮑菇液體培養(yǎng)基優(yōu)化配方比為:黃豆粉3%、酵母膏0.1%、葡萄糖3%、硫酸鎂0.05%、硫酸鐵0.01%、磷酸二氫鉀0.05%、維生素B10.001 %時,菌絲得率和胞外多糖得率分別達(dá) 9.692 g/L和537 mg/L。此配方與未經(jīng)優(yōu)化組合相比較,菌體和多糖產(chǎn)量分別提高了6.3 %、7.6 %。因此,如果這些物質(zhì)能夠得到有效利用,對降低食用菇的生產(chǎn)成本及提高它的品質(zhì)有重要的意義。

3.4 各種組分及重金屬含量評估

利用凱氏定氮儀、纖維分析儀和梅特勒水分儀對杏鮑菇發(fā)酵前后培養(yǎng)基中的各組分進(jìn)行測量，結(jié)果見表3。發(fā)酵前后蛋白質(zhì)及纖維素含量均有顯著提高,蛋白質(zhì)含量提高了22.65%,這主要是由于杏鮑菇菌絲體生物固氮作用,將原有的無機(jī)氮轉(zhuǎn)為有機(jī)氮,使廢棄菌糠發(fā)酵后的粗蛋白和粗脂肪的含量提高；纖維素含量提升45.61%,可能是因杏鮑菇培養(yǎng)基中的木質(zhì)素被降解,使纖維素、與半纖維素的比例增加。李令堂等[15]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)杏鮑菇廢料添加量為30%～40%時,平菇菌絲體的長速、長勢、滿袋天數(shù),平菇產(chǎn)量總和,生物學(xué)效率,子實(shí)體的直徑、菌柄長度、菌蓋厚度均與對照基本相同,均可以達(dá)到良好的生產(chǎn)效果,適宜替代部分棉籽殼、玉米芯作為平菇培養(yǎng)基的原料。

表3 杏鮑菇培養(yǎng)基發(fā)酵前后的成分分析 %

重金屬元素分析結(jié)果見表4。從表4中可看出,培養(yǎng)基發(fā)酵后,Pb和Mn的含量增加最為明顯,As、Cu、Cd、Ni和Zn也有不同程度的增加。施巧琴等[16]研究表明:食用菌對重金屬的積累主要通過體內(nèi)生物大分子與重金屬離子結(jié)合形成不溶性物質(zhì)或沉淀,以及細(xì)胞壁對重金屬的吸附作用。外生菌根真菌基本上都是高等擔(dān)子菌,它們對金屬具有較強(qiáng)的耐受性,其耐受性機(jī)理主要有離子交換、形成絡(luò)合物、沉淀作用和結(jié)晶化作用等,食用菌還有一些其他的重金屬耐受機(jī)制,如將重金屬排除體外、形成金屬絡(luò)合物等,從而減輕重金屬對自身的毒害,富集較高濃度的重金屬。參考《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》NY525—2012可知,標(biāo)準(zhǔn)僅對砷、汞、鉛、鎘、鉻等5項(xiàng)指標(biāo)做出了安全限制規(guī)定,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明,廢棄菌糠中5項(xiàng)指標(biāo)符合其要求,因此,將菌糠發(fā)酵腐熟后作為有機(jī)肥料施入土壤中,不僅能夠充分利用菌糠內(nèi)部蘊(yùn)涵的豐富的營養(yǎng)物質(zhì),而且對重金屬污染土壤有一定的修復(fù)作用。

表4 培養(yǎng)基發(fā)酵前后的元素含量分析 μg·g-1

4 結(jié)論

本文采用傅里葉紅外光譜(FTIR)、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MASS)、離子色譜儀(ICS)、場發(fā)射掃描電鏡(FESEM)和能譜等檢測手段,對杏鮑菇培養(yǎng)基發(fā)酵前后各種元素含量、營養(yǎng)物質(zhì)的變化規(guī)律和形貌分析測試與對比,通過實(shí)驗(yàn)研究和數(shù)據(jù)分析得出以下結(jié)論:

(1) 發(fā)酵過程中杏鮑菇可通過自身合成漆酶將木質(zhì)素降解,使醇羥基相對比例增加,進(jìn)而引起發(fā)酵后吸附水比例相應(yīng)增加；

(2) 杏鮑菇培養(yǎng)基內(nèi)含有大量已分解但尚未利用的小分子營養(yǎng)物質(zhì),并且殘留菌絲豐富了培養(yǎng)基中的蛋白營養(yǎng),其粗蛋白的含量相比發(fā)酵前培養(yǎng)基提高了22.65%,這些營養(yǎng)物質(zhì)可以被平菇有效利用,作為栽培平菇的原料；

(3) 發(fā)酵后培養(yǎng)基中砷、汞、鉛、鎘、鉻等5項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到安全限制規(guī)定。因此,以發(fā)酵后培養(yǎng)基為基質(zhì)作覆土直接施用的多向利用的可行性、安全性均得以保障,并且不會對環(huán)境造成二次傷害,可實(shí)現(xiàn)廢棄物的循環(huán)利用；

(4) 通過離子色譜儀檢測的結(jié)果表明,發(fā)酵前的杏鮑菇培養(yǎng)基富含鉀、鈣、鎂和磷等多種營養(yǎng)元素,經(jīng)過發(fā)酵后,鉀、鎂、磷元素被不同程度吸收,鈣元素的含量有所提升,為杏鮑菇的培養(yǎng)基篩選和優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ)；

(5) 通過場發(fā)射掃描電鏡觀察,發(fā)酵后的杏鮑菇培養(yǎng)基表面因酶解作用而出現(xiàn)許多皺褶和不規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu),可有效提高基質(zhì)對水分的吸附性能,其表面豐富的羥基、羰基、羧基、酰胺基、磷酸基等還可以螯合廢水中的金屬陽離子,這為菌糠作為二次培養(yǎng)基質(zhì)、土壤基質(zhì)、有機(jī)肥料等原料提供了理論依據(jù)。

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