肝細(xì)胞癌中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)及臨床應(yīng)用進(jìn)展

彭邦劍，黃文斌，趙娟娟，潘明新

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州 510280)

肝細(xì)胞癌(HCC)是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了根治性手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，即使可行手術(shù)治療，術(shù)后也極易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可明顯提高HCC患者的生存時(shí)間和生存質(zhì)量。甲胎蛋白(AFP)作為HCC最經(jīng)典的血清腫瘤標(biāo)志物，已在臨床上普遍使用，但其敏感性和特異性都不令人滿意。因此，尋找敏感、特異的腫瘤標(biāo)志物一直臨床研究的熱點(diǎn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是存在于外周血循環(huán)中各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，可自發(fā)或因診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落。大部分CTCs在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，只有極少數(shù)腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來(lái)。由于其在人體外周血中含量極少，在大量的血細(xì)胞中富集并鑒定出這一類特殊細(xì)胞非常困難。目前主要通過(guò)物理特性或生物學(xué)特性等從外周血中富集CTCs，富集到的CTCs再經(jīng)免疫熒光標(biāo)記法、RNA原位雜交法、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞的核質(zhì)比例法進(jìn)一步排除非CTCs?，F(xiàn)已證實(shí)，CTCs在肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤血行轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。本文結(jié)合文獻(xiàn)就HCC中CTCs的檢測(cè)技術(shù)及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述。

1 HCC外周血中CTCs檢測(cè)技術(shù)

CTCs在腫瘤患者外周血中含量極少，即使在已知的轉(zhuǎn)移性腫瘤患者外周血中也存在很少，故從大量血細(xì)胞中富集并鑒定出這一類特殊細(xì)胞非常困難。目前，臨床上可用于富集CTCs的技術(shù)近百余種，其原理主要是基于CTCs的物理特性和生物學(xué)特性，但均無(wú)法避免血細(xì)胞污染。要進(jìn)一步明確CTCs與腫瘤生物學(xué)的關(guān)系，避免其他細(xì)胞的影響，必須對(duì)富集的CTCs進(jìn)行鑒定。目前常用的鑒定方法主要有基于免疫熒光標(biāo)記法、RNA原位雜交法、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞的核質(zhì)比例法等。

1.1 CTCs富集技術(shù) 基于CTCs物理特性的技術(shù)主要集中在尺寸大小、可塑性、密度梯度或介電性質(zhì)等方面。由于CTCs密度比紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞小，依據(jù)這一特性，通過(guò)密度梯度離心的方法分離外周血中不同的細(xì)胞組分，這是早期分離CTCs的方法，目前已很少單獨(dú)使用該方法富集CTCs。商業(yè)化產(chǎn)品CanpatrolTM系統(tǒng)、ISET?系統(tǒng)和ScreenCell?系統(tǒng)等利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜富集CTCs，由于白細(xì)胞尺寸偏小且容易形變，能通過(guò)微孔被去除，而CTCs尺寸較大且細(xì)胞骨架較硬，不易形變，很難通過(guò)濾膜而被截留下來(lái)。Qi等[2]通過(guò)CanpatrolTM系統(tǒng)從112例HCC患者(包含早期HCC)外周血中富集CTCs，其中111例患者富集到CTCs。ApoStream?系統(tǒng)是利用電介質(zhì)的差異來(lái)富集CTCs，其在血液中捕獲腫瘤細(xì)胞的效率超過(guò)75%，其捕獲的MDA-MB-231細(xì)胞的存活率高于97.1%，并且培養(yǎng)至第7天時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有差異。由于根據(jù)物理特性篩選CTCs易混雜其他血細(xì)胞，并且可能會(huì)遺漏掉部分腫瘤細(xì)胞，目前采用物理特性的方法富集CTCs的研究越來(lái)越少。

在生物學(xué)特性中，大多數(shù)方法是基于免疫親和性，如免疫磁珠富集法、流式細(xì)胞術(shù)分選等。免疫磁珠富集法是指依靠細(xì)胞表面標(biāo)志物，將抗體包被在磁珠表面成為免疫磁珠，主要分為正向富集和負(fù)向富集。CellSearch?系統(tǒng)采用正向富集的策略，基于上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)陽(yáng)性CTCs，將腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)志物EpCAM抗體包被在磁珠表面，通過(guò)EpCAM抗體特異結(jié)合在CTCs表面，在外加磁場(chǎng)的作用下分選出CTCs。Sun等[3]采用CellSearch?系統(tǒng)對(duì)73例接受HCC手術(shù)患者進(jìn)行CTCs分布模式研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在外周靜脈血、外周動(dòng)脈血、肝靜脈、肝后下腔靜脈和門靜脈中富集到CTCs的患者比例分別為68.49%、45.21%、80.82%、39.72%和58.90%。負(fù)向富集是通過(guò)剔除血細(xì)胞的方法來(lái)分選CTCs。Guo等[4]采用負(fù)向富集的方法結(jié)合多標(biāo)志物組合模型對(duì)60例HCC患者外周血進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后1個(gè)月患者外周血CTCs明顯下降。表明CTCs模型在HCC診斷中具有較高的敏感性和特異性，可作為風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和治療監(jiān)測(cè)的實(shí)時(shí)參數(shù)。此外，隨著流式細(xì)胞術(shù)分選技術(shù)的發(fā)展，其也逐漸被用于CTCs富集。有研究發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測(cè)CTCs在體外是可行的，并與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，但其在體內(nèi)檢測(cè)敏感性較差，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果不一致，這使流式細(xì)胞術(shù)單獨(dú)應(yīng)用于CTCs富集受到了限制。但流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合其他富集技術(shù)在CTCs提純方面具有較好的效果，為進(jìn)一步在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)等方面分析CTCs提供了基礎(chǔ)[5]。D′Avola等[6]描述了一種結(jié)合成像流式細(xì)胞儀和單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)來(lái)識(shí)別患者CTCs的方法，其利用CD45陰性富集去除白細(xì)胞，然后使用IFC選擇CTCs，最后進(jìn)行scRNA-seq，該系統(tǒng)捕獲效率高達(dá)65%，并且該系統(tǒng)獲得的CTCs基因表達(dá)譜存在明顯異質(zhì)性，這或許可為個(gè)性化檢測(cè)CTCs以及制定相關(guān)治療方案提供新方法。但到目前為止，基于EpCAM的CellSearch?系統(tǒng)仍然是惟一一個(gè)獲得FDA(2004年獲批)和CFDA(2012年獲批)批準(zhǔn),用于惡性腫瘤檢測(cè)CTCs的商業(yè)化產(chǎn)品。

微流控芯片技術(shù)富集CTCs需要極少的血液數(shù)量，無(wú)論是基于物理特性還是生物學(xué)特性，均具有較高的敏感性，近年來(lái)受到越來(lái)越多關(guān)注。當(dāng)外周血細(xì)胞流過(guò)微流控芯片時(shí)，目標(biāo)抗體陽(yáng)性的CTCs將會(huì)停留下來(lái)。有研究將配體-受體結(jié)合測(cè)定應(yīng)用于微流體裝置中的CTCs芯片，其在人造CTCs血液樣品中的捕獲率超過(guò)85%，在36例HCC患者中檢測(cè)到的CTCs為(14±10)個(gè)/2 mL[7]。Qin等[8]開(kāi)發(fā)了一種新型簡(jiǎn)單的楔形微流體裝置，用于高效分離癌癥患者血液樣本中的CTCs，該方法對(duì)HepG2、SKBR3、A549、BGC823四種肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)異的分離性能(超過(guò)85%的捕獲效率)；在臨床試驗(yàn)中，該平臺(tái)鑒定的HCC患者外周血CTCs陽(yáng)性率為83.3%。類似地，HB Chip、GEM Chip和GO Chip通過(guò)設(shè)計(jì)微管道的結(jié)構(gòu)，并在管道上包被EpCAM抗體，當(dāng)外周血流經(jīng)包被有EpCAM抗體的管道時(shí)，CTCs被捕獲并固定在芯片表面上。目前，采用多種抗體組合模型的微流控芯片技術(shù)用于富集HCC患者外周血CTCs已經(jīng)成熟，這種方法有能力去捕獲那些EpCAM低表達(dá)或者不表達(dá)的CTCs，但這種方法必須找到合適的標(biāo)志物區(qū)別于非CTCs，才能被臨床應(yīng)用。此外，Kalinich等[9]介紹了一種高通量微流體的CTC-iChip，它能有效地從血液標(biāo)本中消耗造血細(xì)胞，并為CTCs提供保存完好的RNA，可為后續(xù)下游形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)等研究提供完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

CTCs富集技術(shù)多種多樣，無(wú)論是基于物理特性還是生物學(xué)特性，都不能很好地解釋遺漏CTCs或者白細(xì)胞污染的問(wèn)題，多重富集技術(shù)的組合模型可能是未來(lái)的一條出路，但要如何將這些技術(shù)規(guī)范化、正規(guī)化是一個(gè)難點(diǎn)，相信不久的將來(lái)會(huì)有更多新的CTCs富集方法或者組合模型出現(xiàn)，為后續(xù)的CTCs與HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等機(jī)制的研究開(kāi)辟新的道路。

1.2 鑒定技術(shù) 免疫熒光標(biāo)記是最常用的一種CTCs鑒定技術(shù)，該技術(shù)主要基于細(xì)胞抗原-抗體反應(yīng)來(lái)將CTCs區(qū)別于其他細(xì)胞，故合適的熒光抗體或熒光抗體組合是關(guān)鍵。CellSearch?系統(tǒng)是使用該方法對(duì)CTCs進(jìn)行鑒定，在這個(gè)平臺(tái)上，通過(guò)使用一種核內(nèi)染色劑(DAPI)來(lái)進(jìn)行免疫組化染色，其中的熒光抗體可特異性反向結(jié)合CD45，也可與CK8、CK18、CK19(細(xì)胞質(zhì)上皮標(biāo)志物)結(jié)合。但有研究發(fā)現(xiàn)，CTCs在脫離腫瘤組織進(jìn)入血液進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。與其他上皮性腫瘤不同，大部分HCC細(xì)胞并不表達(dá)EpCAM，這在一定程度上限制了基于EpCAM技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。Liu等[10]使用一種基于磁珠負(fù)性富集的方法去除CD45+白細(xì)胞，并改進(jìn)了識(shí)別CTCs的標(biāo)志物，該團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用三種組合抗體——CD45-、去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)和氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)來(lái)標(biāo)記HCC外周血CTCs，最后采用三重免疫熒光染色處理的方法，將目標(biāo)細(xì)胞分選出來(lái)，結(jié)果在91%(29/32)的HCC患者中檢測(cè)到了ASGPR和(或)CPS1+CTCs，而在其他腫瘤患者中未檢測(cè)到，抗ASGPR和CPS1單克隆抗體的混合物比單獨(dú)任一抗體鑒定HCC細(xì)胞的敏感性和特異性明顯增加。此外，包括DAPI+、CD45-、ASGPR+、HspPar1+、DAPI+、CD45-、CK+、pERK/Akt+等在內(nèi)的標(biāo)志物抗體組合也被用于CTCs的鑒定技術(shù)。

通過(guò)多重探針標(biāo)記的RNA原位雜交法實(shí)現(xiàn)CTCs鑒定和分型也是常見(jiàn)的鑒定方法之一。Canpatrol系統(tǒng)[11]即是應(yīng)用這一原理，該系統(tǒng)針對(duì)EMT途徑，同時(shí)對(duì)上皮標(biāo)志物(如EpCAM、CK8、CK18、CK19)和間質(zhì)標(biāo)志物(如Twist、Vimentin)進(jìn)行檢測(cè)。有研究表明，在HCC患者外周血中，間質(zhì)型CTCs更多見(jiàn)于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移患者的外周血樣本中，并且存在的數(shù)量越多，提示患者預(yù)后越差[12]。Qi等[2]應(yīng)用該系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，112例HCC患者(包含早期HCC)中有111例(90.18%)CTCs陽(yáng)性；另外，在12例乙型肝炎病毒感染患者中，有2例患者亦檢測(cè)到CTCs，這2例患者在5個(gè)月內(nèi)均檢測(cè)到微小HCC。除了商業(yè)化產(chǎn)品Canpatrol系統(tǒng)外，Guo等[4]對(duì)HCC外周血首先采用CD45負(fù)性富集，然后利用qRT-PCR的方法對(duì)多標(biāo)記物表征(EpCAM、CD133、CD90和CK19)的CTCs進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該鑒定技術(shù)在HCC的診斷中具有高度敏感性和特異性，可作為風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和治療監(jiān)測(cè)的實(shí)時(shí)參數(shù)。

免疫熒光標(biāo)記法和RNA原位雜交法是目前常用的兩種CTCs鑒定技術(shù)，但是這兩種技術(shù)都高度依賴相應(yīng)的標(biāo)志物，表征CTCs標(biāo)志物不同將直接導(dǎo)致CTCs鑒定的敏感性和特異性不同。此外，基于流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞的核質(zhì)比例法等也有文獻(xiàn)報(bào)道。Ogle等[13]首先采用負(fù)向富集的方法剔除血細(xì)胞，剩下的細(xì)胞懸液采用流式細(xì)胞成像術(shù)檢測(cè)細(xì)胞角蛋白、EpCAM、AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和DNA-PK，然后分析大小、形態(tài)和DNA含量，依此來(lái)鑒定HCC外周血CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在65.2%的HCC患者血液樣本中檢測(cè)到1～1 642個(gè)CTCs。Guo等[14]發(fā)現(xiàn)了一種新的策略來(lái)檢測(cè)HCC外周血CTCs，同樣利用流式細(xì)胞儀分選，該系統(tǒng)基于HCC患者外周血細(xì)胞的核質(zhì)比例聯(lián)合生物標(biāo)志物EpCAM和CD45分選CTCs，而不是傳統(tǒng)的單一標(biāo)志物或者多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)新的CTCs鑒定方法更敏感和更可靠。

CTCs能否預(yù)測(cè)臨床結(jié)局并進(jìn)一步評(píng)估抗腫瘤藥物的治療效果，最終還要依賴CTCs鑒定技術(shù)是否準(zhǔn)確可靠。但至今關(guān)于HCC的CTCs檢測(cè)仍然沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性是CTCs在臨床應(yīng)用中面臨的最大挑戰(zhàn)，不斷提高CTCs檢測(cè)技術(shù)并使之規(guī)范化成為了今后研究CTCs的重點(diǎn)。

2 HCC外周血CTCs檢測(cè)的臨床應(yīng)用

目前多種多樣的富集方法和多分子靶標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)使得肝癌CTCs的富集與鑒定技術(shù)獲得了較好的敏感性和特異性，在臨床分期、預(yù)后評(píng)價(jià)和療效評(píng)估等方面已經(jīng)逐步開(kāi)展相應(yīng)的研究并取得了一定成果。

2.1 臨床分期 研究表明，外周血CTCs陽(yáng)性率及腫瘤分期(BCLC分期、TNM分期)呈正相關(guān)關(guān)系，有肉眼血管侵犯及肝外轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)CTCs陽(yáng)性率更高。Schulze等[15]應(yīng)用CellSearch?系統(tǒng)檢測(cè)HCC外周血發(fā)現(xiàn)，CTCs計(jì)數(shù)與患者總生存率、BCLC分期、微血管侵犯、AFP等密切相關(guān)，這與Sun等[1]報(bào)道基本一致。CTCs分為上皮型、混合型、間質(zhì)型三種，不同表型的CTCs能從不同方面反映HCC患者臨床特征，可作為評(píng)估HCC患者病情的輔助指標(biāo)。應(yīng)用CellSearch?系統(tǒng)檢測(cè)HCC外周血CTCs時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在很多TNM分期提示為早期HCC患者外周血中也能檢測(cè)到CTCs[8]，這從側(cè)面反映HCC早期即有可能發(fā)展為全身性疾病，僅僅依靠現(xiàn)有的臨床分期不能真實(shí)反映HCC的生物學(xué)特點(diǎn)。因此，倘若能夠?qū)TCs應(yīng)用于常規(guī)檢查，如同乳腺癌一樣納入NCCN指南將會(huì)有利于HCCs患者的早期診斷，并能監(jiān)測(cè)患者預(yù)后，進(jìn)而延長(zhǎng)患者的生存期。

2.2 預(yù)后判斷 Sun等[1]首次描述了在HCC患者中使用CellSearch?系統(tǒng)檢測(cè)EpCAM陽(yáng)性CTCs，認(rèn)為術(shù)前CTCs計(jì)數(shù)≥2是HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因子。有文獻(xiàn)報(bào)道，CTCs計(jì)數(shù)與HCC患者不良臨床病理特征相關(guān)，并且可能預(yù)示患者預(yù)后不良，Sun等[16]的薈萃分析也證實(shí)了這一結(jié)論。Wang等[12]采集了62例行根治性切除術(shù)后HCC患者外周血5 mL，采用CanPatrol系統(tǒng)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)切除術(shù)后總CTCs、混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs復(fù)發(fā)率明顯增高，而上皮型CTCs復(fù)發(fā)率沒(méi)有差別。Ou等[17]應(yīng)用CanPatrol系統(tǒng)在根治性手術(shù)前從165例HCC患者獲得外周血樣品檢測(cè)CTCs，結(jié)果表明間質(zhì)型CTCs的存在提示最短的無(wú)復(fù)發(fā)生存率，其次是混合型CTCs，然后是上皮型CTCs，這與Wang等[18]報(bào)道基本一致。

2.3 療效評(píng)估 CTCs的檢測(cè)在評(píng)價(jià)分期及預(yù)后方面已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，然而在監(jiān)測(cè)療效方面相對(duì)較少。Shen等[19]評(píng)估了EpCAM陽(yáng)性CTCs計(jì)數(shù)在預(yù)測(cè)不能切除的HCC患者經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞后死亡風(fēng)險(xiǎn)，將89例患者分為3組，即低度組(CTCs計(jì)數(shù)為0～1)、中度組(CTCs計(jì)數(shù)為2～5)和高度組(CTCs計(jì)數(shù)≥6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高、中度組死亡風(fēng)險(xiǎn)分別為低度組的2.819(95%CI：1.218～6.526)、1.301倍(95%CI：0.630～2.685)。Guo等[4]對(duì)多標(biāo)記物表征的肝細(xì)胞特征CTCs進(jìn)行大樣本研究，結(jié)果證實(shí)其在HCC中具有高度敏感性和特異性，可作為風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和治療監(jiān)測(cè)的實(shí)時(shí)參數(shù)，腫瘤切除后CTCs負(fù)荷持續(xù)高值患者具有明顯復(fù)發(fā)傾向，可早期制定有效的抗腫瘤策略。此外，包括pERK和pAkt，EMT標(biāo)志物(Twist和波形蛋白)，MAGE-3和生存素，CK、EpCAM和Glypican-3，膜聯(lián)蛋白V、EpCAM、ASGPR1和TAMPs等多標(biāo)記組合的CTCs檢測(cè)也可用于評(píng)估轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及監(jiān)測(cè)藥物治療效果。

綜上所述，CTCs分析可能為臨床醫(yī)生和研究人員提供個(gè)性化策略，因?yàn)镃TCs是敏感的生物標(biāo)志物，有望在早期診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和藥物耐藥等方面發(fā)揮重要作用，以促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的實(shí)施。因此，進(jìn)一步篩選高存活力、高轉(zhuǎn)移性的肝癌CTCs子集，是深入研究HCC靶向轉(zhuǎn)移機(jī)制的關(guān)鍵一步。然而，在臨床上應(yīng)用CTCs分析前，必須建立一種能夠捕獲全部CTCs高敏感性和特異性的方法。目前，大多數(shù)研究是單中心病例對(duì)照研究，樣本量有限，今后需要進(jìn)行足夠樣本量和長(zhǎng)期隨訪的多中心前瞻性研究，以評(píng)估CTCs檢測(cè)和鑒定方法，以便CTCs更好地用于HCC臨床分期、預(yù)后評(píng)價(jià)和療效評(píng)估等。