大鼠肝損傷過程中肝組織神經(jīng)營養(yǎng)因子神經(jīng)突蛋白水平變化及其意義研究

周濤，朱美意，周杰，曹東，歐陽軍

隨著現(xiàn)代工業(yè)和交通業(yè)的迅猛發(fā)展，各類事故所致腹部閉合性損傷日漸增多，而腹部創(chuàng)傷中肝損傷較常見，占腹部創(chuàng)傷發(fā)生率＞20%［1］。嚴重肝損傷的傷情復雜，并發(fā)癥多，病死率為10%［2］。目前對肝損傷的研究主要集中在免疫性、化學性肝損傷，而對機械性肝損傷的研究相對較少。神經(jīng)突蛋白（Neuritin）作為神經(jīng)營養(yǎng)因子在多個器官表達，其在肝損傷及修復過程中的變化及作用尚未被研究。因此本研究建立大鼠肝損傷模型，采用免疫組化法觀察肝損傷后不同時間點肝組織Neuritin水平，以初步探討Neuritin在肝損傷修復過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Neuritin免疫組化一抗為多克隆山羊抗體（型號AF283），購于美國R&D公司，相應二抗（型號：PV-9003）購于北京中杉金橋生物技術有限公司，10%水合氯醛購于MERCK，肝素購于南京化學試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設備 自制改良型BIM-IV生物撞擊機購于第三軍醫(yī)大學；Sartorius電子天平（型號：PRACTUM124-1CN）購自深圳市盛美儀器有限公司；鼠板由本院實驗室提供。

1.3 實驗動物、分組及造模

1.3.1 實驗動物、分組 清潔級SD大鼠126只，由新疆醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心〔許可證號XJZZQ（XK）200301〕提供，6周齡，雌雄不限，體質量（200±20）g。2015年11月—2016年11月，采用隨機數(shù)字表法將SD大鼠分為空白組（42只）、非肝損傷組（42只）、肝損傷組（42只）。

1.3.2 造模 各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，取仰臥位固定于鼠板。肝損傷組采用自制改良型BIM-IV生物撞擊機建立肝損傷模型：將大鼠右側腹部置于自制改良型BIM-IV生物撞擊機打擊頭下，對其劍突與右肋弓夾角處行2次打擊致肝臟鈍性撞擊破裂傷，肝損傷造模成功與否根據(jù)美國創(chuàng)傷外科協(xié)會（AAST）肝損傷分級標準［3］評判；非肝損傷組大鼠于同一部位給予同一力度致其股骨骨折；空白組不給予任何處置。

1.4 標本采集 分別于造模后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d采用隨機數(shù)字表法在各組選取7只大鼠，處死大鼠，完整取下?lián)p傷肝組織并使用Sartorius電子天平測量其重量，10%甲醛溶液固定，常規(guī)包埋、切片。從股動脈處取靜脈血l～2 ml并肝素化，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min（離心半徑3 cm），取血清、分裝并于4 ℃保存待用。

1.5 肝組織HE染色 取肝組織石蠟塊，制備切片（4 μm），進行HE染色，顯微鏡下（×200）觀察肝組織病理情況。

1.6 檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平 將血清送往石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，由固定專業(yè)檢驗人員利用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST水平。

1.7 檢測肝組織Neuritin水平 取肝組織石蠟塊，制備切片（4 μm），進行免疫組化染色，采用Envision兩步法：切片脫蠟至水，微波加熱（95 ℃、15 min）以修復抗原，H2O2孵育10 min以減少背景染色；4 ℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液（PBS）震洗3次，5 min/次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；PBS震洗3次，5 min/次；DAB顯色后進行蘇木素核復染、脫水、透明、封固、干燥。以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性對照為損傷肝組織標本。計算免疫組化得分（IS），IS采用AB值法來計算：A為染色面積，按切片中顯色細胞比例評分，1分為顯色細胞數(shù)占切片中細胞總數(shù)的1/3以下，2分為顯色細胞數(shù)占切片中細胞總數(shù)的1/3～2/3，3分為顯色細胞數(shù)占切片中細胞總數(shù)的2/3以上；B為染色強度，按切片中細胞有無顯色及深淺評分，0分細胞無著色，1分細胞顯色為淺黃色，2分細胞顯色為深黃色，3分細胞顯色為棕褐色；SI=A×B。以SI代表Neuritin水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩變量間的相關性采用直線相關分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝組織HE染色結果 空白組、非肝損傷組各時間點均可見肝細胞排列規(guī)則整齊，胞質、細胞核大小形態(tài)正常，胞質嗜酸性，細胞膜完整，無變性壞死，無炎性細胞浸潤。肝損傷組造模后6 h時可見肝細胞排列不規(guī)則、胞質疏松化及氣球樣變；造模后12 h、1 d、2 d時可見肝細胞大片壞死甚至出現(xiàn)細胞核脫失；造模后3 d、5 d時可見肝細胞排列、胞質、細胞核大小形態(tài)接近正常（見圖1）。

2.2 血清ALT、AST水平 3組造模后6 h、12 h、1 d、2 d血清ALT、AST水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；3組造模后3 d、5 d血清ALT、AST水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其中肝損傷組造模后6 h、12 h、1 d、2 d血清ALT、AST水平高于空白組、非肝損傷組，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。空白組、非肝損傷組造模后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d血清ALT、AST水平組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；肝損傷組造模后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d血清ALT、AST水平組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。其中肝損傷組造模后12 h血清ALT、AST水平高于造模后6 h，造模后2 d、3 d、5 d血清ALT、AST水平低于造模后6 h、12 h，造模后2 d、3 d、5 d血清ALT、AST水平低于造模后1 d，造模后3 d、5 d血清ALT、AST水平低于造模后2 d，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05，見表1）。

2.3 肝組織Neuritin水平 3組造模后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d肝組織Neuritin水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；3組造模后5 d肝組織Neuritin水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其中肝損傷組造模后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d肝組織Neuritin水平高于空白組、非肝損傷組，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）?？瞻捉M、非肝損傷組造模后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d肝組織Neuritin水平組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；肝損傷組造模后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d肝組織Neuritin水平組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。其中肝損傷組造模后12 h、1 d肝組織Neuritin水平高于造模后6 h，造模后3 d、5 d肝組織Neuritin水平低于造模后6 h，造模后1 d、2 d、3 d、5 d肝組織Neuritin水平低于造模后12 h，造模后2 d、3 d、5 d肝組織Neuritin水平低于造模后1 d，造模后3 d、5 d肝組織Neuritin水平低于造模后2 d，造模后5 d肝組織Neuritin水平低于造模后3 d，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05，見圖2、表2）。注：與空白組比較，ap＜0.05；與非肝損傷組比較，bp＜0.05；與造模后6 h比較，cp＜0.05；與造模后12 h比較，dp＜0.05；與造模后1 d比較，ep＜0.05；與造模后2 d比較，fp＜0.05；與造模后3 d比較，gp＜0.05

圖1 3組肝組織HE染色結果（×200)Figure 1 HE staining results of liver tissue in three groups

表1 3組血清ALT、AST水平比較（，U/L，n=7）Table 1 Comparison of serum ALT and AST levels measured at different measurement times in three groups

表1 3組血清ALT、AST水平比較（，U/L，n=7）Table 1 Comparison of serum ALT and AST levels measured at different measurement times in three groups

注：ALT=丙氨酸氨基轉移酶，AST=天冬氨酸氨基轉移酶；與空白組比較，ap＜0.05；與非肝損傷組比較，bp＜0.05；與造模后6 h比較，cp＜0.05；與造模后12 h比較，dp＜0.05；與造模后1 d比較，ep＜0.05；與造模后2 d比較，fp＜0.05

空白組 41.2±9.2 42.2±8.5 44.7±9.4 43.0±5.3 43.2±9.0 39.2±7.6 0.27 0.93非肝損傷組 45.3±7.0 40.7±6.6 42.4±7.4 47.2±6.2 45.0±5.8 42.0±6.4 0.89 0.51肝損傷組 261.2±18.4ab 429.2±8.4abc 242.2±15.3abcd 115.0±11.8abcde 53.0±5.4cdef 47.8±8.0cdef 901.46 ＜0.01 F值 603.61 4 834.46 627.45 142.49 3.42 2.04 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.06 0.16組別 AST F值 P值造模后6 h 造模后12 h 造模后1 d 造模后2 d 造模后3 d 造模后5 d空白組 69.3±9.5 68.8±12.8 71.0±10.7 77.0±9.2 73.7±12.2 65.2±10.6 0.85 0.52非肝損傷組 71.8±12.8 73.7±11.9 75.7±9.5 83.2±9.5 72.5±11.8 67.3±11.7 1.30 0.29肝損傷組 275.3±10.8ab 778.2±30.6abc 410.2±16.9abcd 200.2±17.6abcde 78.2±6.9cdef 70.7±10.1cdef 1 411.9 ＜0.01 F值 676.43 2 413.08 1 391.64 178.40 0.48 0.39 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.63 0.68

表2 3組肝組織Neuritin水平比較（，n=7）Table 2 Comparison of Neuritin levels in liver tissue measured at different measurement times in three groups

表2 3組肝組織Neuritin水平比較（，n=7）Table 2 Comparison of Neuritin levels in liver tissue measured at different measurement times in three groups

空白組 1.78±0.23 1.70±0.14 1.71±0.17 1.65±0.10 1.76±0.20 1.70±0.16 0.45 0.85非肝損傷組 1.68±0.18 1.78±0.17 1.68±0.22 1.73±0.17 1.68±0.19 1.71±0.14 0.29 0.91肝損傷組 3.72±0.26ab 6.13±0.25abc 4.48±0.19abcd 3.58±0.14abde 3.28±0.18abcdef 1.85±0.27cdefg 240.32 ＜0.01 F值 154.55 995.00 397.32 339.50 128.09 1.06 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.37

圖2 3組肝組織免疫組化染色結果（×200）Figure 2 Immunohistochemical staining of liver tissue in three groups

2.4 肝損傷組肝組織Neuritin水平與血清ALT、AST水平的相關性 肝損傷組肝組織Neuritin水平與血清ALT、AST水平均呈正相關（r=0.796 2，p＜0.001；r=0.769 1，p＜0.001；見圖 3、4）。

3 討論

圖3 肝損傷組肝組織Neuritin水平與血清ALT水平的相關性Figure 3 Correlation between Neuritin levels and serum ALT levels in rats with liver injury

圖4 肝損傷組肝組織Neuritin水平與血清AST水平的相關性Figure 4 Correlation between Neuritin levels and serum AST levels in rats with liver injury

肝臟是再生能力較強的實質性器官，其再生機制異常復雜［4］。肝臟由肝實質細胞及肝非實質細胞組成，其中肝實質細胞數(shù)量占全部肝細胞的80%［5］。有研究者通過表達于肝實質細胞中的鳥氨酸循環(huán)的關鍵酶氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS-1）以及表達于肝非實質細胞中的組織金屬蛋白酶抑制劑2（TIMP-2）對肝實質細胞和肝非實質細胞進行檢測分離發(fā)現(xiàn)，Neuritin僅在肝實質細胞中有表達［6］。日本研究者發(fā)現(xiàn)，在切除成年小鼠70%肝臟后Neuritin水平出現(xiàn)一過性降低，切除手術24 h后，隨著肝臟再生的開始，Neuritin水平開始回升，其水平回升的時間與細胞周期蛋白D1（cyclinD1）一致，而cyclinD1是反映肝臟發(fā)育成熟和再生的指標［6］。由此可以推測，Neuritin在肝臟中對肝細胞的發(fā)育或再生/增殖均有重要作用，其具有潛在的臨床價值。Neuritin是NEDIVI等［7］于1993年在谷氨酸類似物紅藻氨酸鹽的誘導下，從鼠海馬cDNA文庫中篩選和鑒定出的一系列與長期可塑性相關的候選基因15（CPG15）之一。隨后的研究顯示，光刺激可誘導CPG15在大鼠的視覺皮質中表達［8］；對人類腦皮質cDNA文庫篩選得到的CPG15進行初步的功能研究發(fā)現(xiàn)，其能促進神經(jīng)突起的快速生長，故又將其命名為Neuritin［7］。Neuritin是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一種小分子物質，之前有關Neuritin的研究一直集中在神經(jīng)系統(tǒng)、胃、骨折等［9-11］，之后利用免疫組化法對人體正常組織Neuritin水平做了進一步的研究：Neuritin除了在神經(jīng)系統(tǒng)（腦）表達外，在肝組織中也有明顯表達［12］，這與NEDIVI等［13］的研究結果基本一致，證實了Neuritin還參與介導神經(jīng)系統(tǒng)外其他細胞（真皮微血管內(nèi)皮細胞，DMVEC）的再生和細胞形態(tài)學上的生長變化，并在血管領航和網(wǎng)絡形成中發(fā)揮導向作用［14］。Neuritin作為神經(jīng)營養(yǎng)因子在多個器官表達，但其在肝損傷及修復過程中的變化及作用尚未被研究。因此本研究建立大鼠肝損傷模型，采用免疫組化法觀察肝損傷后不同時間點肝組織Neuritin水平，以初步探討Neuritin在肝損傷修復過程中的作用。

ALT、AST主要分布于肝細胞的胞質和線粒體中，而血清中ALT、AST水平較低；當肝實質細胞受損或壞死時，細胞膜通透性增加并導致線粒體損傷，胞質中的ALT、AST大量流出，血清中ALT、AST水平明顯升高，所以血清ALT、AST是肝細胞損傷的敏感指標［15］。本研究結果顯示，非肝損傷組與空白組造模后6 h、12 h、1 d、2 d血清ALT、AST水平無差異；肝損傷組造模后6 h、12 h血清ALT、AST水平高于空白組、非肝損傷組；肝損傷組造模后12 h血清ALT、AST水平高于造模后6 h，造模后2 d、3 d、5 d血清ALT、AST水平低于造模后6 h、12 h；提示造模成功。肝損傷組造模后1 d、2 d血清ALT、AST水平高于空白組、非肝損傷組；3組造模后3 d、5 d血清ALT、AST水平無差異；肝損傷組造模后2 d、3 d、5 d血清ALT、AST水平低于造模后1 d，造模后3 d、5 d血清ALT、AST水平低于造模后2 d；說明ALT、AST水平升高主要由肝損傷引起，從而排除生物撞擊引起其他組織損傷對ALT、AST水平的影響。肝組織HE染色結果顯示，空白組、非肝損傷組各時間點均可見肝細胞排列規(guī)則整齊，胞質、細胞核大小形態(tài)正常，胞質嗜酸性，細胞膜完整，無變性壞死，無炎性細胞浸潤；肝損傷組造模后6 h時可見肝細胞排列不規(guī)則、胞質疏松化及氣球樣變，造模后12 h、1 d、2 d時可見肝細胞大片壞死甚至出現(xiàn)細胞核脫失；說明本實驗建立的肝損傷模型是成功的。肝損傷組造模后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5d肝組織Neuritin水平高于空白組、非肝損傷組；肝損傷組造模后12 h、1 d肝組織Neuritin水平高于造模后6 h，造模后3 d、5 d肝組織Neuritin水平低于造模后6 h，造模后1 d、2 d、3 d、5 d肝組織Neuritin水平低于造模后12 h，造模后2 d、3 d、5 d肝組織Neuritin水平低于造模后1 d，造模后3 d、5 d肝組織Neuritin水平低于造模后2 d，造模后5 d肝組織Neuritin水平低于造模后3 d；說明在肝損傷后隨著時間的變化肝組織Neuritin水平有先從低到高，再從高到低的變化。肝損傷組大鼠肝組織Neuritin水平與血清ALT、AST水平均呈正相關，說明大鼠肝損傷后隨著ALT、AST水平升高肝細胞周圍Neuritin水平也上升。因此，推測Neuritin與肝損傷程度、修復密切相關：肝損傷后Neuritin水平升高，可能與肝細胞凋亡有關，同時Neuritin對受損肝細胞有一定的修復作用，其可能參與了肝挫裂傷后的修復過程。Neuritin抗細胞凋亡或促進肝細胞再生的機制可能是：（1）Neuritin通過阻斷半胱氨酸蛋白酶（Caspase）3激活抗凋亡［16］；（2）Neuritin顯著增強衰老大鼠肝臟中過氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及過氧化物酶的活性，能較好地清除自由基、抑制脂質過氧化反應、降低丙二醛水平及延緩細胞衰老［17］；（3）Neuritin通過改善線粒體功能，增加能量合成［16］，從而發(fā)揮保護肝細胞作用；（4）Neuritin可能通過抑制一氧化氮合酶（NOS）活性［18］，從而發(fā)揮抗細胞凋亡及保護細胞膜的作用。

本研究的局限性在于其他物理或化學因素也能引起肝損傷，這些引起肝損傷的因素會不會對Neuritin也有一定影響需進一步研究證實。肝損傷后Neuritin水平升高可能是肝損傷修復作用的結果，也可能是其保護作用中的一環(huán)節(jié)，推測Neuritin可能參與肝損傷后修復，但具體機制仍需進一步研究。因此，進一步探明肝損傷的發(fā)生機制，把握肝損傷修復保護的時間規(guī)律及最佳時間窗，并且進行相應的藥物預處理，則會給肝損傷的防治帶來很好的前景。

綜上所述，大鼠肝損傷后，肝組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子Neuritin水平先升高再降低，與血清中ALT、AST水平變化一致，其可能在肝損傷后肝細胞的再生或增殖過程中發(fā)揮一定的作用，但其具體機制仍需進一步研究。本研究組初步推測Neuritin有可能作為急性肝損傷的分子標志物，為肝損傷的防治發(fā)揮一定的臨床價值。

作者貢獻：周濤進行丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、Neuritin水平檢測；朱美意進行組織學檢查；周杰進行動物實驗；曹東進行信息檢索、論文修改；歐陽軍進行項目設計及指導、質量控制及審核，對文章負責。

本文無利益沖突。

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