溫通針法對(duì)過敏性鼻炎模型大鼠鼻黏膜形態(tài)學(xué)和IL-4影響的實(shí)驗(yàn)研究?

田永萍，鄭先麗Δ，雒海燕，趙耀東，劉翔毅，姜 影，馬承旭，王明娟，劉 敏

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，蘭州 730000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000)

過敏性鼻炎是一種常年發(fā)病、無季節(jié)性的慢性鼻黏膜炎癥疾病，以打噴嚏、水樣清涕、鼻塞為主要特征[1],主要因特異性個(gè)體接觸變應(yīng)原后由IgE介導(dǎo)釋放炎性介質(zhì)、由免疫活性細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)等參與的鼻部變態(tài)反應(yīng)性疾病。過敏性鼻炎的經(jīng)典發(fā)病機(jī)制是在過敏原的刺激下經(jīng)過反應(yīng)形成T細(xì)胞，初始T細(xì)胞可在IL-4存在下分化為2型輔助性T細(xì)胞，經(jīng)過抗體類別轉(zhuǎn)換導(dǎo)致IgE類抗體的產(chǎn)生，與特異性(specificIgE,sIgE)鼻黏膜中肥大細(xì)胞表面的IgEc受體(FcεRI)結(jié)合，從而使機(jī)體處于致敏狀態(tài)，一般在機(jī)體再次接觸相同變應(yīng)原6～9 h達(dá)到高峰，然后逐漸消退[2]。在此期間，肥大細(xì)胞和活化的T細(xì)胞持續(xù)釋放活性遞質(zhì)，促使輔助性T細(xì)胞2(helper T cell 2,Th2)、嗜堿粒細(xì)胞尤其是嗜酸粒細(xì)胞向鼻黏膜組織遷移、黏附、定位，鼻黏膜組織發(fā)生病理改變，導(dǎo)致遲發(fā)反應(yīng)的癥狀[3]。本文從過敏性鼻炎發(fā)病機(jī)制出發(fā)，觀察過敏性鼻炎模型大鼠IL-4表達(dá)和鼻黏膜組織細(xì)胞的變化以驗(yàn)證溫通針法對(duì)過敏性鼻炎的療效，旨在進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)溫通針法治療機(jī)制并提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量150±20 g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001)。

1.1.2 試劑及藥物 卵清白蛋白，Sigma公司，10 g/瓶(批號(hào)709B051)；氫氧化鋁，美侖生物，500 g/瓶(批號(hào)21645-51-2)；生理鹽水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，500 ml/瓶(批號(hào)H62020318)；ELISA試劑盒，欣博盛生物(批號(hào)R160318-002a)；丙酸氟替卡松，葛蘭素史克公司，125μg/瓶(批號(hào)H20130190)。

1.1.3 主要儀器 精密電子天平(OHAUS公司)；10～1000 μL微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號(hào)RT-6100)；高速離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司，型號(hào)TDZ4-WS)；微量振蕩器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)XK96-3)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司，型號(hào)101-2)。

1.2 過敏性鼻炎大鼠模型的建立

1.2.1 基礎(chǔ)致敏實(shí)驗(yàn) 卵清白蛋白混懸液制備：每只大鼠稱取卵清白蛋白0.3 mg，氫氧化鋁15 mg混于1 ml生理鹽水中。30只大鼠稱取9 mg卵清白蛋白和450 mg氫氧化鋁后將其溶和于30 ml生理鹽水中，混勻備用；基礎(chǔ)致敏試驗(yàn)造模[4]：將40只Wistar大鼠按照隨機(jī)原則分為空白對(duì)照組、模型組、藥物治療組、溫通針法組4組各10只，除空白對(duì)照組給予生理鹽水外，其余各組均給予卵清白蛋白混懸溶液腹腔注射1 ml/只，隔日1次，共7次。

1.2.2 過敏性鼻炎模型 卵清白蛋白溶液配制：用卵清蛋白和生理鹽水配置濃度為2%的卵清蛋白混懸液，每只大鼠雙側(cè)鼻孔需滴入0.1 ml，所以30只大鼠稱取60 mg卵清蛋白，然后將其溶于3 ml生理鹽水，混勻備用；局部激發(fā)造模實(shí)驗(yàn)[5]：在致敏試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照原有分組使用50 μL移液槍吸取0.1 ml溶液，對(duì)除空白組之外的其他3組大鼠雙側(cè)鼻孔進(jìn)行滴鼻，每側(cè)0.05 ml，每日1次，連續(xù)7 d?？瞻捉M大鼠給予生理鹽水滴鼻，方法與劑量同模型組。

1.3 模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)[6]

通過激發(fā)實(shí)驗(yàn)，模型大鼠會(huì)出現(xiàn)打噴嚏、撓鼻、抓臉和鼻溢等癥狀。在給藥后30 min內(nèi)對(duì)上述癥狀建立評(píng)分系統(tǒng)：鼻癢：輕度為1 分，輕擦鼻幾次；重度為2分，抓撓鼻、面不止，到處摩擦；噴嚏：1～3 個(gè)為1分，4～10 個(gè)為2分，11 個(gè)以上為3分；清涕：流到鼻前孔為1分，過鼻前孔為2分，流涕滿面為3分。以疊加法記錄總分，總分超過5分即為建模成功。

1.4 干預(yù)治療

1.4.1 藥物治療 藥物組大鼠每天給予丙酸氟替卡松噴鼻50 μL/次/側(cè)，每天1次，連續(xù)治療10 d。

1.4.2 針刺治療 根據(jù)中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》，選取“風(fēng)池”(寰椎翼前緣直上方凹陷中，向后下方斜刺)“印堂”(兩眼眶上緣中點(diǎn)連線與正中線交點(diǎn)，向鼻根部平刺)“迎香”(鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處，向下斜刺)，常規(guī)消毒后左手食指或拇指緊按針穴，右手持0.35×12 mm的毫針刺入穴內(nèi)3 mm深，候氣至，左手加重力量，右手拇指向前連續(xù)捻按9次，針下沉緊后針尖拉著感應(yīng)的部位連續(xù)重插輕提9次，拇指再向前連續(xù)捻按9次，針尖頂著有感應(yīng)的部位推弩守氣使針下繼續(xù)沉緊，每穴操作60 s，然后慢慢將針拔去，按壓針孔，每日1次，連續(xù)治療10 d。

1.5 觀察方法

干預(yù)10 d后，第11天將大鼠用水合氯醛麻醉后心臟負(fù)壓采血，離心收集血清后保存，用ELISA法檢測血清IL-4表達(dá)，具體步驟參照試劑盒說明。大鼠采血后脫頸處死，將大鼠鼻腔打開后取下鼻黏膜組織，用10%甲醛固定后保存，石蠟包埋固定，病理切片后進(jìn)行常規(guī)HE染色，在高倍顯微鏡下觀察組織炎性物質(zhì)浸潤情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1 各組模型大鼠鼻黏膜組織病理切片HE染色結(jié)果(×400)

2 結(jié)果

2.1 溫通針法對(duì)模型大鼠鼻黏膜形態(tài)學(xué)影響

圖1顯示，光鏡下病理形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，空白組黏膜上皮細(xì)胞完整且無破壞，組織未見炎性細(xì)胞浸潤和其他異常(見圖1 A)。模型組可見炎性細(xì)胞浸潤，主要是嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，鼻黏膜上皮細(xì)胞破壞且邊緣不清，組織血管水腫擴(kuò)張(見圖1B)。藥物組黏膜上皮組織基本完整，血管有腫脹、水腫，可見嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，但較模型組減少(見圖1C)。溫針組黏膜上皮組織完整，可見少量嗜酸性粒細(xì)胞，基本接近正常黏膜(見圖1D)。

2.2 溫通針法對(duì)模型大鼠IL-4表達(dá)的影響

表1顯示，模型組大鼠血清中IL-4表達(dá)增加，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療干預(yù)后，與模型組比較藥物組、溫通針法組大鼠血清IL-4含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與藥物組比較，溫通針法組大鼠血清IL-4含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示西藥和溫通針法均可以降低模型大鼠血清中IL-4的表達(dá)，但溫通針法的療效優(yōu)于藥物。

表1 各組大鼠血清IL-4表達(dá)水平影響

注：與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：▲▲P<0.01；與藥物組比較：△P<0.05

3 討論

過敏性鼻炎患者其鼻黏膜下組織中含有大量的嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及多形核白細(xì)胞，均可產(chǎn)生IL-4來導(dǎo)致過敏性鼻炎患者IL-4明顯高于正常人，所以過敏性鼻炎的發(fā)病機(jī)制與IL-4表達(dá)密切相關(guān)。而IL-4可誘導(dǎo)和促進(jìn)IgE產(chǎn)生，故IL-4是調(diào)節(jié)IgE產(chǎn)生的重要因素。IL-4是激活淋巴細(xì)胞使其表達(dá)IgE的重要因子之一，它能導(dǎo)致大量IgE與肥大細(xì)胞表達(dá)的IgE受體結(jié)合，激活肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放一切與炎癥有關(guān)的介質(zhì)，從而引起黏膜水腫、黏液分泌增加[7]。由于這些特性，IL-4一直被認(rèn)為是過敏性疾病和哮喘的潛在靶物。研究顯示[8]，過敏性鼻炎中巨嗜細(xì)胞移動(dòng)抑制因子存在于炎癥位點(diǎn)的嗜酸性細(xì)胞中，嗜酸性粒細(xì)胞在體內(nèi)外均能產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子，過敏性鼻炎患者的嗜酸性粒細(xì)胞能釋放IL-4等多種細(xì)胞因子，從而介導(dǎo)白細(xì)胞的趨化和激活、纖維母細(xì)胞的增生和細(xì)胞外基質(zhì)的形成，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子受體的表達(dá)，從而激發(fā)過敏性反應(yīng)?；谝陨蠙C(jī)制，本研究通過觀察過敏性鼻炎致炎因子IL-4的表達(dá)情況和釋放其組織炎癥細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn)，來驗(yàn)證傳統(tǒng)溫針治療手法對(duì)過敏性鼻炎的治療效果并探討其機(jī)制。

已有研究證明[9]，鼻黏膜形態(tài)學(xué)改變可以用來研究治療過敏性鼻炎的療效且有客觀性。因此本研究通過形態(tài)學(xué)證實(shí)，溫通針法對(duì)過敏性鼻炎模型大鼠鼻黏膜形態(tài)學(xué)的療效具有科學(xué)性和客觀性。通過研究結(jié)果顯示，筆者認(rèn)為溫通針法可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞在鼻黏膜聚集，阻止肥大細(xì)胞脫顆粒釋放炎癥介質(zhì)，從而促進(jìn)黏膜修復(fù)，治療過敏性鼻炎效果較好。

本研究所用溫通針法是在鄭魁山燒山火的基礎(chǔ)上通過溫?zé)崾址ㄡ槾萄ㄎ欢鴣韀10]，從而達(dá)到提升機(jī)體陽氣、增強(qiáng)免疫的治病目的。相關(guān)文獻(xiàn)也曾表明，使用溫通針法后可以增強(qiáng)局部的免疫防御功能，改善鼻部的局部微循環(huán)，同時(shí)具有消炎鎮(zhèn)痛的作用[11]。因此筆者認(rèn)為，溫通針法通過免疫調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)AR有著良好的治療效果和臨床推廣前景。

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