Cd2+對無機磷細(xì)菌生長及溶磷作用的影響①

王玉書，劉 海,2，黃建國*

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Cd2+對無機磷細(xì)菌生長及溶磷作用的影響①

王玉書1，劉 海1,2，黃建國1*

(1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400716；2 貴州省農(nóng)業(yè)科技信息研究所，貴陽 550006)

無機磷細(xì)菌(phosphorus solubilization bacteria, PSB)是重要的土壤有益微生物，它們將植物不能吸收的難溶性無機磷轉(zhuǎn)化為有效磷，對土壤磷素供應(yīng)十分重要。鎘是污染土壤的常見重金屬，研究Cd2+脅迫下PSB的生長和溶磷能力，可揭示鎘污染對土壤無機磷轉(zhuǎn)化供應(yīng)的影響，為改善植物磷素供應(yīng)提供有益信息。試驗以重慶市縉云山國家森林公園毛竹林地分離的4株假單胞菌為供試菌株，比較它們的溶磷能力，研究了不同濃度Cd2+對PSB生長和溶磷作用的影響。結(jié)果表明：供試菌株溶磷能力PSB05>PSB09>PSB07>PSB01，溶磷指數(shù)和溶磷率最高值是最低值的2.08倍和4.14倍。搖瓶培養(yǎng)120 h后，培養(yǎng)液pH表現(xiàn)為PSB01 > PSB07 > PSB09 > PSB05，并與培養(yǎng)液中的無機磷含量()呈顯著負(fù)相關(guān)(= –83.148 pH＋581.96，R＝0.9052，＝25)。在固體培養(yǎng)時，PSB05的溶磷圈和菌落直徑隨培養(yǎng)基中Cd2+濃度提高而降低。在Cd2+濃度0.5~2.0 mg/L液體培養(yǎng)基中，PSB05數(shù)量較無Cd2+對照減少22.09%~68.18%，草酸、乙酸、檸檬酸和氫離子分泌量顯著下降，溶磷量降低5.27%~38.45%。供試菌株的溶磷能力差異顯著；高濃度Cd2+抑制PSB05生長、有機酸和氫離子分泌及溶磷作用，不利于土壤供給磷素。

鎘；無機磷細(xì)菌；溶磷

磷是植物必需的“三要素”之一，其重要性僅次于氮。土壤無機磷一般占全磷的50%~80%，并以難溶狀態(tài)為主[1-2]。無機磷細(xì)菌(phosphorus solubilization bacteria, PSB)是重要的土壤有益微生物，它們將植物不能吸收的難溶性無機磷轉(zhuǎn)化為有效磷，對土壤磷素供應(yīng)和作物生長十分重要[3]。將PSB加入土壤，有效磷提高5.77~14.92 mg/kg[4]。PSB與過磷酸鈣或鋼渣磷肥混合施用，大豆吸磷量分別增加12.3% 和6.2%[5]。Chabot等[6]和Walpola等[7]發(fā)現(xiàn)，PSB促進(jìn)西紅柿、洋蔥、馬鈴薯、香蕉、柑橘、咖啡、蕎麥、莧菜和玉米等作物吸收磷素營養(yǎng)。Taurian等[8]從土壤中分離出59株P(guān)SB，均能不同程度地溶解難溶性磷酸鹽，提高花生生物量，促進(jìn)根系生長和根瘤形成。在PSB溶解無機磷酸鹽的過程中，所分泌的有機酸和氫離子起重要作用[9]。

鎘(Cd)是土壤污染的常見重金屬之一，居12種全球危險性化學(xué)物質(zhì)之首[10]。我國約有74% 的耕地缺磷，必須大量施用磷肥。26 a的定位試驗表明，長期施用過磷酸鈣使土壤Cd含量增加7倍[11]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施用磷肥是造成土壤Cd污染的重要原因。Sheik等[12]和Chai等[13]分析了不同制革廠周邊的土壤樣品，發(fā)現(xiàn)重金屬污染降低土壤細(xì)菌群落多樣性，并分離出能快速溶解大量磷酸鈣、磷礦石或磷酸鋁等難溶性磷酸鹽的sp. PSM11-5，其機理是分泌葡萄糖酸或檸檬酸等溶解磷。在Cd污染環(huán)境中，用內(nèi)生真菌LK5接種野生型和脫落酸缺陷突變體的兩種番茄植株，促進(jìn)植物生長，提高葉綠素含量和氣孔導(dǎo)度，以及根系磷含量[14]；將解磷菌株SJ-101施入鎳污染土壤，顯著增加芥菜生物量[15]；在砷污染土壤中，施用解磷菌株顯著增加玉米根系長度[16]。因此，重金屬污染土壤中可能存在抗性菌株。此外，Cd對土壤微生物產(chǎn)生多方面的危害，包括干擾新陳代謝，降低酶活性，破壞蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，妨礙DNA復(fù)制與修復(fù)，抑制生長繁殖等[17]。土壤中棲息著106~109種微生物，具有不同的生理、生化和生態(tài)功能[18]。但是，目前關(guān)于Cd2+對PSB活化磷影響的認(rèn)識還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

本研究以重慶市縉云山國家森林公園毛竹林地中分離的4株P(guān)SB為供試菌株，比較了它們的溶磷能力，并在培養(yǎng)液中添加不同濃度的Cd2+，研究了溶磷能力最強的菌株??PSB05的生長及溶磷作用，旨在揭示Cd污染對土壤PSB生長和溶磷能力的影響，為改善樹木磷素供應(yīng)提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：PSB01、PSB05、PSB07和PSB09等4株P(guān)SB，屬于變形菌門(Proteobacteria)，γ-變形菌綱(γ-Gammaproteobacteria)，假單胞菌目(Pseudomona-dales)，假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，假單胞菌屬()，從重慶市縉云山國家森林公園毛竹林地(106o20' E，29o49' N，黃壤，pH 4.34)中分離獲得，保存于西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物實驗室。

培養(yǎng)基(g)：瓊脂20，葡萄糖10，磷酸三鈣2.5，(NH4)2SO40.5，NaCl 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，KCl 0.2，酵母膏0.5、MnSO4·4H2O和FeSO4·7H2O各0.002，蒸餾水 1 000 ml，pH 7.0~7.5，液體培養(yǎng)基不含瓊脂，滅菌備用(121℃，30 min，下同)。

Cd2+溶液：用分析純CdCl2·2.5H2O和無離子水配制 100 mg/L母液。

1.2 方法

1.2.1 PSB溶磷能力的測定 取供試PSB，接種于瓊脂固體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測量培養(yǎng)后的菌落和溶磷圈直徑，計算溶磷指數(shù)[19]：溶磷指數(shù)=(菌落直徑+溶磷圈直徑)/菌落直徑。

同時，將PSB分別接種于液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)48 h(28℃，100 r/min，下同)，稀釋至細(xì)菌數(shù)102/ml。取1 ml接種于100 ml培養(yǎng)液中，對照為接等量的滅菌稀釋液，重復(fù)5次，搖瓶培養(yǎng)120 h，離心10 min (4℃，10 000 r/min)。取上清液，用pHS-3C精密酸度計測定pH，鉬藍(lán)比色法測定無機磷含量[20]，并計算溶磷率[21]。溶磷率=[(接菌培養(yǎng)液磷含量–無菌培養(yǎng)液磷含量)×培養(yǎng)液體積/磷酸鈣中的磷量]×100%。

1.2.2 Cd2+對PSB生長和溶磷能力影響的測定 國家《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB15618—2015)規(guī)定，I ~ III類農(nóng)業(yè)用地含Cd量不超過0.25 ~ 1.0 mg/kg。因此，利用CdCl2·2.5H2O母液配制Cd2+濃度(mg/L)分別為0(對照)、0.5(低)、1.0(中)和2.0(高)的液體培養(yǎng)基，各取100 ml于250 ml三角瓶中，滅菌、冷卻，接種PSB05，搖瓶培養(yǎng)120 h，重復(fù)5次。

每隔12 h，用1.2.1中的方法測定培養(yǎng)液pH和無機磷濃度，計算溶磷量(即：培養(yǎng)液無機磷濃度×培養(yǎng)液體積)。培養(yǎng)結(jié)束后，用顯微鏡(XSP-6C，上海迪諾力泰公司)觀測計數(shù)培養(yǎng)液中的PSB。然后，用0.1 mol/L H2SO4酸化培養(yǎng)液，高效液相色譜測定有機酸濃度。色譜條件為：Ion-300有機酸分析專用柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA)，進(jìn)樣量20 μl，流動相2.5 mmol/L 硫酸，流速0.5 ml/min，柱溫35℃，壓力 450 psi，Diode Array L-7455紫外檢測器，檢測波長210 nm。檢測的有機酸包括草酸、檸檬酸和乙酸，其出峰時間(min)依次為9.15、10.51和14.91。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別用 Excel 2010和 SPSS 17.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行基本計算和統(tǒng)計分析，LSD進(jìn)行多重比較，顯著水平為<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSB的溶磷能力

從圖1和表1可見，溶磷圈直徑、溶磷指數(shù)、培養(yǎng)液水溶性無機磷濃度和溶磷率均以PSB05最大，PSB07和PSB09次之，PSB01最小，溶磷指數(shù)、培養(yǎng)液無機磷濃度、溶磷率3指標(biāo)最高值是最低值的2.08倍、3.14倍和4.14倍。此外，在液培結(jié)束時，培養(yǎng)液pH表現(xiàn)為PSB01 > PSB07 > PSB09 > PSB05，并與培養(yǎng)液水溶性無機磷濃度()呈顯著負(fù)相關(guān)(= –83.148pH+581.96，R=0.9052，=25)。

2.2 Cd2+ 對PSB05菌株生長的影響

考慮到PSB05溶磷能力最強，故以其為對象研究Cd2+對PSB05菌株生長和溶磷作用的影響。在固體培養(yǎng)時，Cd2+濃度越高，PSB05菌落直徑越小，即Cd2+抑制生長的作用越強(圖2)。在液體培養(yǎng)時，Cd2+對PSB05生長的影響類似固體培養(yǎng)，PSB05數(shù)量比無Cd2+對照減少22.09% ~ 68.18%(圖3)。

圖1 固體培養(yǎng)PSB的溶磷狀況

表1 不同PSB菌株的溶磷能力

注:同列不同小寫字母表示不同菌株間差異顯著(<0.05)，下同。

圖2 Cd2+對PSB05菌株生長的抑制作用

(圖中不同小寫字母表示處理間差異在<0.05水平顯著)

圖3 液體培養(yǎng)中Cd2+對PSB05菌株數(shù)量的影響

2.3 Cd2+ 對PSB05分泌有機酸和氫離子的影響

在PSB05的培養(yǎng)液中，分別檢測到草酸、乙酸和檸檬酸。其中，檸檬酸濃度最高，乙酸次之，草酸最低 (表2)。低、中濃度Cd2+促進(jìn)草酸分泌，提高培養(yǎng)液中的草酸濃度；高濃度Cd2+則產(chǎn)生抑制作用，草酸濃度比對照降低32.55%。隨Cd2+濃度提高，培養(yǎng)液乙酸含量降低；在高Cd2+濃度的培養(yǎng)液中，乙酸含量比對照降低67.83%。與對照相比，低Cd2+促進(jìn)檸檬酸分泌，培養(yǎng)液檸檬酸含量提高；中、高濃度Cd2+則產(chǎn)生抑制作用，降低培養(yǎng)液中的檸檬酸濃度。

由表2可見，與乙酸類似，隨Cd2+濃度提高，培養(yǎng)液中的氫離子含量降低。在高Cd2+培養(yǎng)液中，氫離子含量比對照降低84.16%。

2.4 Cd2+對PSB05菌株溶磷量的影響

在固體培養(yǎng)基中加入Cd2+，不僅菌落直徑降低，同時也減小溶磷圈直徑(圖2)。在液體培養(yǎng)基中，隨培養(yǎng)時間延長，PSB05的溶磷量逐漸增加，可用對數(shù)方程=a·ln()＋b描述溶磷量()與培養(yǎng)時間()之間的關(guān)系(圖4)。值得注意的是，Cd2+顯著降低溶磷量，Cd2+濃度越高，降幅越大。液培120 h后，PSB05的溶磷量(mg/瓶)分別是19.17(對照)、18.16(低Cd2+)、15.99(中Cd2+)和11.80(高Cd2+)。

表2 PSB05菌株培養(yǎng)液中的有機酸和氫離子濃度

3 討論

土壤有效磷對PSB的溶磷作用產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，低磷促進(jìn)PSB溶解磷酸鹽，高磷則產(chǎn)生抑制作用[22]。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，大量施用磷肥使PSB的效果欠佳。森林一般不施肥，主要依靠土壤供給磷素[23-24]，熱帶和亞熱帶森林土壤有效磷極低，故微生物活化土壤無機磷對于樹木磷素供應(yīng)十分重要[25]。

在培養(yǎng)液中加入Cd2+，PSB05數(shù)量成倍減少，說明Cd2+對PSB具有強烈毒性，類似Cd2+對固氮菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌等生長繁殖的影響[26-27]。Cd2+與微生物DNA和RNA中的磷酸結(jié)合，抑制復(fù)制和轉(zhuǎn)錄或使堿基配對錯誤[26]；Cd2+與蛋白質(zhì)分子中的羥基、氨基、巰基結(jié)合后，改變其空間結(jié)構(gòu)與功能；Cd2+還能競爭或破壞酶活性位點，干擾土壤微生物的相關(guān)代謝[28-30]。因此，在培養(yǎng)條件下，外源Cd2+強烈抑制稻田土壤功能微生物??厭氧固氮菌及產(chǎn)甲烷菌的生物活性，但抑制強度存在顯著的種群差異[26]。謝曉梅[31]發(fā)現(xiàn)，Cd2+對土壤微生物具有廣譜毒性，抑制細(xì)胞生長繁殖，減少種群數(shù)量，降低多樣性。在Cd污染土壤中，可培養(yǎng)微生物總數(shù)大幅度減少，但不同種群的微生物對Cd2+的敏感性不一樣，導(dǎo)致微生物種群結(jié)構(gòu)改變[32]。Cd2+對明亮發(fā)光桿菌()的毒性強弱可能與細(xì)胞壁對Cd2+的親和性密切相關(guān)，這是因為光合細(xì)菌的細(xì)胞壁含有羧基、羥基、醛基等帶負(fù)電荷的基團，可吸附帶正電荷Cd2+，故微生物細(xì)胞壁的負(fù)電荷越多，對Cd2+親和性則越強，其毒性也越大[33-34]。因此，Cd2+可能干擾PSB05細(xì)胞分裂，妨礙新陳代謝，抑制生長或造成死亡。在Cd本底值較高或遭受Cd污染的森林土壤中，除Cd與磷酸鹽結(jié)合(Ksp= 2.53×10–33)降低可溶性磷含量之外，還可能通過抑制PSB生長繁殖，妨礙溶磷，引起植物缺素。

圖4 不同濃度Cd2+脅迫下PSB05菌株的溶磷量

PSB主要依賴于分泌低分子量的有機酸和氫離子活化土壤難溶性磷酸鹽[35-36]。在PSB05培養(yǎng)液中，檢測到檸檬酸、草酸和乙酸，檸檬酸與鈣、鐵、鋁的絡(luò)合(沉淀)常數(shù)(lg)分別為3.42、25.00、20.00；草酸與鈣、鐵、鋁的依次是3.00、20.20、16.30，遠(yuǎn)高于相應(yīng)鈣、鐵、鋁等離子與磷的絡(luò)合(沉淀)常數(shù)[37-39]。因此，PSB分泌的檸檬酸和草酸可溶解土壤難溶性鈣、鐵、鋁磷酸鹽，釋放無機磷[40]。草酸和乙酸還是較強的有機酸，能電離大量的氫離子，直接溶解氟磷灰石、氯磷灰石、羥磷灰石等。供試4株P(guān)SB均能溶解磷酸三鈣，培養(yǎng)液的pH與水溶性無機磷濃度呈線性負(fù)相關(guān)。有人從豆科植物根際分離出12種芽孢桿菌(sp.)，與假單胞菌(sp.)相似，均能分泌氫離子溶解磷酸鈣[41-42]；伯克霍爾德菌(CC-A174)能分泌葡萄糖酸，電離出質(zhì)子，溶解各類磷灰石[43]；在石灰性土壤中，青霉(和)能在NH4+存在時溶解磷酸鹽，溶磷量與pH呈負(fù)相關(guān)[44-45]。因此，高Cd2+抑制PSB05分泌草酸、乙酸、檸檬酸和氫離子，這可能是固體培養(yǎng)溶磷圈減小和液體培養(yǎng)溶磷量降低的直接原因。

PSB合成與分泌有機酸的速率關(guān)系到培養(yǎng)液中的有機酸含量。在PSB05培養(yǎng)液中，高Cd2+降低有機酸濃度，意味著合成或分泌受到抑制。由于Cd2+降低三羧酸循環(huán)(TAC)多種酶的活性[46]，直接涉及檸檬酸和乙酸生物合成，它們同時也是草酸合成的直接(乙酸)和間接前體(檸檬酸)[47]。Cd2+抑制TAC酶活性可能降低PSB有機酸生物合成。此外，Cd2+與微生物DNA和RNA中的磷酸結(jié)合[26]，可能抑制有機酸合成酶基因組表達(dá)，減少相關(guān)酶的合成量。有機酸經(jīng)細(xì)胞膜上的陰離子通道分泌進(jìn)入培養(yǎng)液[48]，Cd2+對陰離子通道蛋白的變構(gòu)作用抑制其活性，降低有機酸分泌速率。因此，Cd2+可能既抑制PSB有機酸合成又妨礙其分泌。但是，在Cd2+濃度較低時，促進(jìn)PSB分泌草酸和檸檬酸，有益于螯(絡(luò))合Cd2+，減輕傷害，這種現(xiàn)象可視為保護性生理反應(yīng)，也意味著PSB合成分泌有機酸對高低濃度的Cd2+有不同響應(yīng)。

4 結(jié)論

4株假單胞菌的溶磷能力差異較大；高濃度Cd2+抑制PSB生長、有機酸和氫離子分泌及溶磷作用。研究不同菌株的溶磷作用及其對Cd2+的抗性有望獲得高效優(yōu)良的PSB，可用于Cd污染土壤的修復(fù)及改善。

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Effects of Cadmium on Growth and Phosphate Dissolving Abilities of Inorganic Phosphorus Bacteria

WANG Yushu1, LIU Hai1,2, HUANG Jianguo1*

(1 College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Guizhou Institute of Agricultural Science and Technology Information, Guiyang 550006, China)

Phosphorus (P) solubilization bacteria (PSB) is a group of important beneficial microbes which influence the ability of soil P supply due to the transformation of insoluble inorganic P unavailable for plants into available state. Cadmium (Cd) is a heavy metal commonly found in pollution soils. To study the growth and P dissolving ability of PSB under Cd2+stress could be helpful to further understand the effects of P transformation and supply in Cd polluted soils and to provide the beneficial information on the improvement of plant P nutrition. In this paper, 4 PSB strains ingenus isolated from moso bamboo () soil in Jinyun National Forest Park in Chongqing, were used to compare their P-dissolving abilities, and to study the changes in their growth and P solubilization in the culture mediums with Cd2+added in different concentrations. The results showed that P dissolving abilities changed in a sequence of PSB05 > PSB09 > PSB07 > PSB01. The highest P dissolving index and P dissolving rate were 2.08 times and 4.14 times than those of the lowest, respectively. After being shaken for 120 hours, pH of culture solution showed an order of PSB01 > PSB07 > PSB09 > PSB05, and a negative correlation was found between soluble inorganic P and pH value (soluble inorganic P =–83.148 pH＋581.96,2=0.9052,=25). The colony and P-dissolving-ring diameters of PBS05 strains grown on solid culture mediums were decreased with Cd2+concentrations increased. In liquid culture mediums with Cd2+0.5–2.0 mg /L, the number of PSB05 strains was reduced by 22.09%–68.18% compared with no Cd2+. Simultaneously, the efflux of oxalate, acetate, citrate and proton was inhibited by PSB05 strains, and the amount of inorganic P that dissolved from insoluble phosphates was reduced by 5.27%–38.45%. PSB strains tested in the present experiment varied significantly in P dissolving abilities. Cd2+inhibited microbial growth, organic acid and proton efflux and P solubilization at high concentrations, which is unbeneficial to P supply for in trees in forests.

Cadmium; Inorganic phosphorus bacteria; Soluble phosphorus

貴州省煙草公司遵義市公司科研項目(201503)資助。

(huang99@swu.edu.cn)

王玉書(1991—)，男，山西陽泉人，碩士研究生，主要研究方向為土壤微生物。E-mail: 969014327@qq.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.01.028

S144

A