高血壓病氣虛血瘀證患者血清凋亡相關蛋白含量測定及意義※

● 胡小勤 黃大利 蒙玉梅 吳 培 王 強

高血壓病是臨床常見的一種疾病[1]，氣虛血瘀證是高血壓病的常見證型[2]，也是血瘀證的常見亞型[3]。高血壓病[4]以及氣虛血瘀證[5]都與細胞凋亡密切相關。筆者在以往的體外實驗中發(fā)現(xiàn)，高血壓病氣虛血瘀證患者血清可以誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡[6]，但是高血壓病氣虛血瘀證患者體內(nèi)細胞凋亡的情況尚不清楚。

細胞凋亡(apoptosis)是指多細胞生物為調(diào)控機體發(fā)育，維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞主動死亡過程[7]。Caspases家族的激活是凋亡進行的必須途徑。其中，Caspase-3是整個凋亡級聯(lián)反應的一個關鍵調(diào)節(jié)點[8]。P53基因?qū)Φ蛲鲇姓T導作用[9]。Fas與其配體FasL結(jié)合可誘導Fas表達細胞發(fā)生凋亡，是細胞凋亡最主要的途徑之一[10]。

因此，為了進一步闡明高血壓病氣虛血瘀證與細胞凋亡的關系，本文檢測了高血壓病氣虛血瘀證患者血清凋亡相關蛋白Caspase-3、P53、Fas、FasL的含量，并分析其臨床意義。

1 材料

1.1試劑ELisa試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2儀器臺式低溫離心機為Thermo公司產(chǎn)品；全波長酶標儀為Biotek公司產(chǎn)品；微量移液器為Eppendorf公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1患者及健康體檢者的選擇選擇高血壓病氣虛血瘀證、高血壓病非氣虛血瘀證患者各40例，為2016年7月至2017年1月期間廣西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科高血壓病確診者。高血壓病診斷按照2013ASH/ISH高血壓管理指南的診斷標準。氣虛血瘀證，按照我國1986年修訂的氣虛證診斷標準(全國中西醫(yī)結(jié)合虛證及老年病防治學術會議制訂的《中醫(yī)虛證辨證參考標準》)及2011年修訂的血瘀證診斷標準(中國中西醫(yī)結(jié)合學會活血化瘀專業(yè)委員會制定的《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療共識》)。健康對照組選擇健康體檢者20例，三組在性別和年齡方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高血壓病氣虛血瘀證、高血壓病非氣虛血瘀證患者的血壓無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性。

2.2人血清收集空腹取血后，置入不抗凝無菌帶帽干燥試管，自凝后，4℃，2000r·min-1離心15min，取上清液置無菌EP管，混勻，滅活，過濾除菌，凍存于-80℃，備用。用于實驗的血清分別為各組患者及健康體檢者的混合血清。

2.3分組分3組，分別是高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓病非氣虛血瘀證組、健康組。

2.4 ELISA檢測各組血清蛋白含量按ELISA試劑盒說明進行檢測。

3 結(jié)果

3.1各蛋白標準曲線圖見圖1～4。

3.2血清中各蛋白含量

3.2.1 各組血清中Caspase-3、P53含量 關于Caspase-3，高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較，含量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01；高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01。

關于P53，高血壓病氣虛血瘀證組與健康組比較，含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01；高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較，含量無明顯變化；高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01。見表1。

表1 血清中Caspase-3、P53含量

注：與健康組相比，**P<0.01；與高血壓病非氣虛血瘀證組相比，△△P<0.01。

3.2.2 各組血清中Fas、FasL含量 關于Fas，高血壓病氣虛血瘀證組與健康組比較，含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01；高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較，含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01；高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，含量升高，但無統(tǒng)計學差異，P>0.05。

關于FasL，高血壓病氣虛血瘀證組與健康組比較，含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01；高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較，含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01；高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01。見表2。

表2 血清中Fas、FasL含量

注：與健康組相比，**P<0.01；與高血壓病非氣虛血瘀證相比，△△P<0.01。

4 討論

經(jīng)典的細胞凋亡途徑有兩條，分別為細胞外途徑(或稱細胞表面死亡受體途徑)和細胞內(nèi)途徑(或稱線粒體引發(fā)途徑)[11]。

研究表明：細胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶caspase級聯(lián)反應(cascade)事件的結(jié)果，caspase-3被證實處于該級聯(lián)反應的下游，是凋亡的關鍵執(zhí)行者[12]。

P53蛋白具有確切的促進細胞凋亡的功能。通過Bax/Bcl-2、Fas/Apol、IGF-BP3等蛋白，P53可完成對細胞凋亡的調(diào)控作用。P53可以上調(diào)Bax的表達水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達，通過線粒體途徑共同完成促進細胞凋亡作用。P53還可通過死亡信號受體蛋白途徑誘導凋亡，如TNF受體和Fas蛋白[13]。

Fas/FasL系統(tǒng)在細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導過程中尤為重要。Fas是TNF受體家族I型跨膜蛋白及FasL的受體，相對分子質(zhì)量45kD；FasL是TNF家族II型跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量40kD，F(xiàn)as與其配體FasL或Fas抗體結(jié)合可誘導Fas表達細胞發(fā)生凋亡，是細胞凋亡最主要的途徑之一[14]。

實驗結(jié)果表明：與健康組相比，高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓病非氣虛血瘀證組血清中的Caspase-3、P53、Fas、FasL表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。另外，與高血壓病非氣虛血瘀證組相比，高血壓病氣虛血瘀證組Caspase-3、P53、FasL表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與以往的關于上述蛋白在細胞凋亡的作用的研究結(jié)果一致[15-17]。本實驗結(jié)果說明：高血壓病氣虛血瘀證患者存在細胞凋亡，其機制可能與Caspase-3、P53、Fas、FasL表達量升高有關。其中，與氣虛血瘀證密切相關的蛋白主要為Caspase-3、P53、FasL。具體的凋亡途徑，初步判斷與Fas/FasL途徑有關，至于與其他受體及線粒體途徑是否相關，有待于進一步研究。

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