牛筋草對百草枯、草甘膦和草銨膦的抗藥性水平測定

胡 芳，董慧榮，沈雪峰，劉 俊，魏吉平，陳 勇

(華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣東 廣州 510642)

【研究意義】牛筋草(EleusineindicaL.)是禾本科單子葉植物，多生長于旱生作物田、果園或路邊，生命力較強，表現(xiàn)出極大的競爭優(yōu)勢，已被列為世界十大惡性雜草之一[1-2]。雜草在田間的大量生長對作物生產(chǎn)造成極大損失[3]，由于過度依賴和長期使用相對單一的化學除草劑，已導致牛筋草對多種除草劑產(chǎn)生了抗藥性，主要包括聯(lián)吡啶類、有機磷類、膦酸類、二硝基苯胺類、環(huán)己烯酮類、二苯醚類、乙酰乳酸合成酶抑制劑類和乙酰輔酶A抑制劑類等[4-10]?！厩叭搜芯窟M展】百草枯和草甘膦是全球使用最廣泛的滅生性除草劑[11-14]。百草枯的使用已有50多年的歷史[15]，在其應用大約30年后的1980年，在臺灣省發(fā)現(xiàn)第一例抗百草枯雜草-白酒草(Conyzasumatrensis)，其后抗百草枯雜草在許多國家均有報道[16]。2010年，在馬來西亞的苦瓜農(nóng)場發(fā)現(xiàn)百草枯對牛筋草的防效很不理想，進一步的研究發(fā)現(xiàn)其GR50是敏感性的3.60倍[2]。草甘膦具有獨特的作用方式及代謝機制，在土壤中殘留量極低，一度認為在田間不可能出現(xiàn)抗性雜草[17]。然而，1996年首先在澳大利亞發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的瑞士黑麥草(Loliumrigidum)對草甘膦的抗性提高了7.00 ～ 11.00倍[18]。2000年，在馬來西亞發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的牛筋草種群[19]。隨著草甘膦抗藥性雜草的出現(xiàn)和百草枯水劑在國內(nèi)被禁用，20世紀80年代開發(fā)的有機磷類滅生性除草劑—草銨膦具有吸收好、活性高、殺草譜廣、低毒等特點逐漸被用于防除田間和果園雜草[13, 20-22]。然而，2010年，第一個抗草銨膦的牛筋草種群在馬來西亞被發(fā)現(xiàn)[20]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在我國華南地區(qū)750 ～ 1500 g a.i./hm2劑量的草銨膦對柑橘園中禾本科雜草的防效在85 %以上[23]。2009年楊松等[24]在海南香蕉園發(fā)現(xiàn)20 %草銨膦在試驗劑量下，對老齡牛筋草的防除不徹底，目測似干枯，但莖部以下未干枯，藥后15 d未完全干枯的雜草開始有新葉抽出。雜草多抗性是指一種抗性雜草生物型同時對兩種或兩種以上作用機理完全不同的除草劑產(chǎn)生的抗藥性[16]。2010年馬來西亞發(fā)現(xiàn)對草銨膦和百草枯存在多抗性的牛筋草種群[2]。2015年，澳大利亞發(fā)現(xiàn)了對百草枯、草甘膦、草銨膦和乙酰輔酶A抑制劑類除草劑產(chǎn)生多抗性的牛筋草種群[22]。但是，雜草多抗性產(chǎn)生的機制還未見報道，已經(jīng)存在的抗百草枯或者草甘膦的牛筋草能否加速對草銨膦產(chǎn)生抗藥性，目前知之甚少。【本研究的切入點】本試驗以廣東省不同地區(qū)的牛筋草種子為材料，采用整株生物測定法法、培養(yǎng)皿法和莽草酸含量法，探索了采自不同用藥歷史地區(qū)的牛筋草種群對這3種除草劑的抗藥性水平?！緮M解決的關鍵問題】目前，在國內(nèi)尚未見有關百草枯、草甘膦和草銨膦多抗性牛筋草種群的相關報道。本文旨在通過對廣東省不同地區(qū)牛筋草抗藥性的監(jiān)測，篩選出對百草枯、草甘膦和草銨膦產(chǎn)生多抗性的種群，為延緩抗藥性雜草的發(fā)展、科學合理治理抗藥性雜草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗材料 13個牛筋草種群于2016年采集于廣東省不同地區(qū)，種子采集信息和用藥歷史如表1所示。

1.1.2 供試儀器及藥劑 3WP-2000型行走式噴霧塔(農(nóng)業(yè)部南京農(nóng)業(yè)機械化研究所制)；智能人工氣候室(廣州市深華生物技術有限公司)；電子天平(上海民橋有限公司)；低溫臺式離心機；UV-2550型紫外分光光度計(島津儀器蘇州有限公司)。

20 %的百草枯水劑(湖北仙隆化工股份有限公司)；30 %草甘膦異丙胺鹽水劑(美國孟山都公司)；20 %的草銨膦水劑(浙江永農(nóng)科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛筋草種群對百草枯的抗藥性水平測定 采用溫室盆栽法培養(yǎng)。將去殼的各種群牛筋草種子分別播種于盛有營養(yǎng)土和沙土(2∶1,v/v)的育苗盆中，待長到2 ～ 3葉期移入花盆(d=9 cm)中，每盆4株，置于32 ℃/25 ℃晝夜12 h交替光照，光強為800 μE·m-2·s-1，相對濕度為80 %的溫室中培養(yǎng)，定期澆水。

待幼苗長至5 ～ 7葉期，采用行走式噴霧塔進行莖葉噴霧，測定不同種群牛筋草對百草枯的抗性水平。噴施劑量依次為0、75.00、150.00、300.00、600.00、1200.00 g a.i./hm2。以清水為對照，4次重復。噴藥14 d后，稱取地上部鮮重。

1.2.2 牛筋草種群對草甘膦的抗藥性水平測定 采用培養(yǎng)皿監(jiān)測法。將去殼的各種群牛筋草種子在200 mg·L-1濃度的赤霉素中浸泡20 min 以打破休眠。根據(jù)Cirujeda和Duran等方法[25-26]，將打破休眠后的種子均勻移入鋪有兩層濾紙并加入5 mL不同濃度草甘膦的培養(yǎng)皿中(d=9 cm)，草甘膦設置7個劑量濃度：0、61.50、123.00、153.75、184.50、215.25、246.00 g a.i./hm2，每個培養(yǎng)皿20粒種子。以清水為對照，4次重復。置于32 ℃/25 ℃晝夜12 h交替光照，光強為800 μE·m-2·s-1，相對濕度為80 %的溫室中培養(yǎng)，定期給培養(yǎng)皿中加入等量的水以保持濕潤。培養(yǎng)7 d后，每個培養(yǎng)皿中隨機選取10株測定根長。

莽草酸含量法。該試驗以培養(yǎng)皿法監(jiān)測到的敏感型種群JM和兩個抗性較強的種群QY01和CZ種群為材料。采用溫室盆栽法待其生長至5 ～ 7葉期，選取生長一致的牛筋草，進行1.50倍田間推薦劑量草甘膦處理，分別在施藥后1、2、3、5、7、9 d分別剪取抗性和敏感型牛筋草植株的地上部分莖葉測定莽草酸含量。

莽草酸含量測定方法[27]：取0.50 g莖葉組織，研缽中研磨成勻漿后加入1 mL 0.25 mol·L-1HCl，4 ℃離心(12 000 r/min, 15 min)，取上清液于5 mL離心管中，放置在冰上。4次重復。取200 μl上清液，加入2 mL 1 %過碘酸溶液，混勻，靜置3 h后再加入1 mol·L-1的NaOH溶液2 mL，0.1 mol·L-1甘氨酸1.2 mL，混勻靜置5 min，測定380 nm處的吸光值。根據(jù)莽草酸標準曲線計算出抗性和敏感型牛筋草植株地上部分莖葉中的莽草酸含量。

表1 牛筋草種子采集地點和用藥史Table 1 The location and herbicide application background of Eleusine indica populations

莽草酸標準曲線制作[28]：將10 mg的莽草酸標準樣品溶于1 mL 0.25 mol·L-1HCl中，分別取0、1.00、2.50、5.00、10.00、40.00、50.00、100.00 μl于試管中，加0.25 mol·L-1HCl至1 mL。與莽草酸含量測定的相同步驟測定OD值。

1.2.3 牛筋草種群對草銨膦的抗藥性水平測定 采用溫室盆栽法測定。待幼苗長至4 ～ 6葉期，采用行走式噴霧塔進行莖葉噴霧，測定不同種群牛筋草對草銨膦的抗藥性水平。噴施劑量依次為0、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00、1600.00、3200.00 g a.i./hm2。以清水為對照，4次重復。噴藥14 d后，稱取地上部鮮重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010和Originpro 9.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，根據(jù)牛筋草鮮重、根長和藥劑用量擬合出毒力回歸方程，求出抑制中劑量GR50值，并根據(jù)各種群GR50值得出抗藥性倍數(shù)(IR)計算公式如下：

Y=aln[-bln(x)]

其中，Y代表抑制率，x代表藥劑濃度;

敏感(IR<2)；低抗(210)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛筋草種群對百草枯的抗藥性監(jiān)測

由表2可知，廣東省不同地區(qū)的牛筋草種群對百草枯的抗藥性水平存在明顯的差異。其中，MZ04種群對百草枯抗藥性水平最低，其GR50值僅為24.29 g a.i./hm2； QY05種群對百草枯的抗性水平最高，其GR50值為314.43 g a.i./hm2，是敏感型種群MZ04的12.94倍。該監(jiān)測結(jié)果表明，采集的樣品中大約61 %的牛筋草種群對百草枯處于中到高水平抗性，其種群分別為MZ02、QY01、ZQ02、PY06、NX、CZ、QY02、QY05，GR50值在146.16 ～ 314.43 g a.i./hm2。

2.2 牛筋草種群對草甘膦的抗藥性監(jiān)測

由表3可以看出，采用培養(yǎng)皿法監(jiān)測結(jié)果表明，廣東省不同地區(qū)的牛筋草種群對草甘膦的抗藥性水平存在明顯的差異。其中JM種群對草甘膦抗藥性水平最低，其ED50值僅為25.29 g a.i./hm2；QY01牛筋草種群對草甘膦抗性水平最高，其ED50值為380.88 g a.i./hm2，是敏感型種群MZ04的15.12倍。該監(jiān)測結(jié)果表明，采集的樣品中54 %的牛筋草種群對草甘膦處于中到高水平抗性，其種群分別為QY4、QY05、NX、MZ02、PY06、CZ、QY01，ED50值在108.40 ～ 380.88 g a.i./hm2。

由圖2可知，草甘膦處理后，植株體內(nèi)莽草酸含量會隨著噴施時間逐漸積累。而在JM種群植株體內(nèi)莽草酸積累量要顯著高于QY01和CZ種群。QY01和CZ種群植株體內(nèi)的莽草酸只有輕微的積累，草甘膦處理9 d后，植株體內(nèi)的莽草酸僅為32.62和52.23 μg·g-1。而種群JM植株體內(nèi)的莽草酸含量迅速增加，草甘膦處理9 d后，植株體內(nèi)莽草酸含量高達1934.36 μg·g-1。該結(jié)果表明，JM種群為敏感型牛筋草種群，而QY01和CZ為抗性型牛筋草種群。

表2 不同牛筋草種群對百草枯的抗藥性Table 2 GR50 values and resistance levels of the Eleusine indica populations in relation to paraquat

表3 不同牛筋草種群對草甘膦的抗藥性Table 3 ED50 values and resistance levels of the Eleusine indica populations in relation to glyphosate

圖1 莽草酸標準曲線Fig.1 Shikimic acid standard curve

圖2 草甘膦處理對牛筋草種群莽草酸含量的影響Fig.2 Effect of glyphosate on the content of shikimic acid in the Eleusine indica populations

表4 不同牛筋草種群對草銨膦的抗藥性Table 4 GR50 values and resistance levels of the Eleusine indica populations in relation to glufosinate

2.3 牛筋草種群對草銨膦的抗藥性監(jiān)測

由表4可以看出，廣東省不同地區(qū)的牛筋草種群對草銨膦的抗藥性水平也存在明顯的差異。其中NX種群對草銨膦抗藥性水平最低，其GR50值僅為6.37 g a.i./hm2; CZ牛筋草種群對草銨膦的抗性水平最高，其GR50值為41.08 g a.i./hm2，是敏感型種群NX的6.45倍。結(jié)果表明，采集的樣品中沒有監(jiān)測到高抗性種群，31 %的牛筋草種群對草銨膦處于中水平抗性，其種群分別為ZQ02、PY07、PY06、CZ，GR50值在30.65 ～ 41.08 g a.i./hm2。

2.4 篩選對百草枯、草甘膦和草銨膦產(chǎn)生多抗性的牛筋草種群

結(jié)合以上抗性監(jiān)測結(jié)果可知，CZ、PY06、QY01、QY05、MZ02和NX種群存在對百草枯和草甘膦產(chǎn)生多抗性的可能；CZ和PY06種群存在對草甘膦和草銨膦產(chǎn)生多抗性的可能；CZ、PY06和ZQ02種群存在對百草枯和草銨膦產(chǎn)生多抗性的可能；因此，CZ和PY06種群對這3種除草劑存在多抗性的可能。其中MZ04、JM和NX分別為百草枯、草甘膦和草銨膦的敏感型牛筋草種群(圖3～5)。

圖3 抗性型和敏感型牛筋草種群的百草枯劑量Fig.3 The dose of resistance and sensitive Eleusine indica populations to paraquat

3 討 論

近年來抗百草枯牛筋草已有大量報道，本試驗中與百草枯敏感牛筋草種群相比，抗性牛筋草種群的相對抗性水平達到12.94倍，高于馬來西亞抗性型牛筋草種群[2]，但與沈雪峰等幾年前的監(jiān)測結(jié)果(抗性生物型牛筋草的相對抗性水平達到59.48倍)相比，抗性下降很多[11]。這可能與生產(chǎn)中禁用百草枯有關[13]。本研究中與草甘膦敏感牛筋草種群相比，抗性牛筋草種群的相對抗性水平達到15.12倍，顯著高于2000年馬來西亞報道的8.00 ～ 12.00倍和2011年在美國發(fā)現(xiàn)的抗性倍數(shù)為12.00的牛筋草種群[19, 29]。然而，由于培養(yǎng)皿法簡單，快捷可用于從大量種群中快速篩選出抗性和敏感型種群，但抗性等級可能存在一定誤差[30]。草甘膦處理植物后，植株體內(nèi)的莽草酸含量會大量積累[31]。而在敏感型植株體內(nèi)莽草酸的積累量要顯著高于抗性植株，莽草酸含量的多少可以證明雜草產(chǎn)生抗藥性水平的高低[32-33]。結(jié)果表明，JM為草甘膦敏感牛筋草種群，QY01和CZ為草甘膦抗性牛筋草種群，說明培養(yǎng)皿法存在的誤差較小，可以作為監(jiān)測牛筋草對草甘膦的抗藥性水平。

圖4 抗性型和敏感型牛筋草種群的草甘膦劑量Fig.4 The dose of resistance and sensitive Eleusine indica populations to glyphosate

圖5 抗性型和敏感型牛筋草的草銨膦劑量Fig.5 The dose of resistance and sensitive Eleusine indica populations to glufosinate

隨著草甘膦抗藥性雜草的出現(xiàn)和百草枯水劑在國內(nèi)被禁用，草銨膦逐漸被用于防除田間和果園雜草，據(jù)廣東省不同地區(qū)果農(nóng)反映，草銨膦對牛筋草的防效卻不理想，通過對采集的樣品進行監(jiān)測，與草銨膦敏感牛筋草種群相比，抗性牛筋草種群的相對抗性水平達到6.45倍，這與馬來西亞和澳大利亞抗草銨膦生物型牛筋草研究的結(jié)果相似[21, 23]。這可能與百草枯在生產(chǎn)中被禁用，而草銨膦被用來填補市場空白有關[34]。本研究所采集的13個牛筋草種群中已有4個種群對草銨膦產(chǎn)生中等水平的抗藥性，其中CZ、PY06和PY07均有草銨膦用藥史，而ZQ02種群無草銨膦用藥史，產(chǎn)生這種情況的原因可能與百草枯和草甘膦長期使用產(chǎn)生抗性后，導致植株表觀特性(葉片表面蠟質(zhì)層厚度和表面絨毛疏密)發(fā)生改變，減少除草劑的吸收有關，以至于對草銨膦也產(chǎn)生了抗藥性。

結(jié)合牛筋草對百草枯、草甘膦和草銨膦的抗性監(jiān)測結(jié)果可知，CZ和PY06種群對以上3種除草劑存在多抗性。這與2010年馬來西亞和2015年余勤教授在澳大利亞發(fā)現(xiàn)的對百草枯、草甘膦、草銨膦產(chǎn)生多抗性的牛筋草種群研究結(jié)果相似[2, 22]。國內(nèi)外對百草枯、草甘膦和草銨膦等除草劑開展了較為長期的監(jiān)測及其抗性相關機理的研究，但尚未能系統(tǒng)闡明其抗性作用機制，在多抗性方面進展則更為緩慢。

4 結(jié) 論

本研究表明，采集的13個樣品對這3種除草劑均存在不同程度的抗藥性，其中CZ、PY06、QY01、QY05、MZ02和NX種群存在對百草枯和草甘膦產(chǎn)生多抗性的可能；CZ和PY06種群存在對草甘膦和草銨膦產(chǎn)生多抗性的可能；CZ、PY06和ZQ02種群存在對百草枯和草銨膦產(chǎn)生多抗性的可能；而CZ和PY06種群則存在對百草枯、草甘膦和草銨膦產(chǎn)生多抗性的可能。本研究結(jié)果為牛筋草的抗藥性監(jiān)測、牛筋草抗藥性機制研究、延緩抗藥性雜草發(fā)展和科學合理治理抗藥性雜草提供理論依據(jù)。

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