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    水淹脅迫下三峽庫區(qū)消落帶適生狗牙根轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄組分析

    2018-03-21 06:26:10李彥杰楊俊年劉仁華周大祥甘麗萍吳應(yīng)梅
    西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2018年2期
    關(guān)鍵詞:水淹牙根形態(tài)學(xué)

    李彥杰,楊俊年,劉仁華,周大祥,2,甘麗萍,吳應(yīng)梅

    (1.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,重慶 萬州 404100;2.重慶大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,重慶市基因功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400300)

    【研究意義】三峽水庫175 m蓄水完成后,使其上游形成長度約660 km,面積約10 000 km2,水位落差達(dá)30 m的周期性冬水夏陸消落帶系統(tǒng)[1]。反季節(jié)性長期水淹環(huán)境破壞了消落帶固有的生態(tài)系統(tǒng),使得從三峽大壩到其上游的重慶江津地區(qū)因?yàn)橄鋮^(qū)植被的退化及破壞而產(chǎn)生了如水土流失和環(huán)境污染加劇等眾多問題[2-3]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了恢復(fù)或重建消落帶生態(tài)系統(tǒng),學(xué)界在耐淹植物的篩選和選育等方面做了大量的工作,已經(jīng)篩選出一些消落帶適生植物,并從形態(tài)學(xué)、生理生化及分子水平初步研究了部分耐淹植物的抗性機(jī)制[4-6]。狗牙根(Cynodondactylon)為三峽庫區(qū)消落帶原生植物,表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐淹能力和環(huán)境適應(yīng)能力,如狗牙根通過莖節(jié)、根及分枝等生長對不同水淹環(huán)境環(huán)境作出響應(yīng)[7]。水淹脅迫時,植物體內(nèi)的活性氧自由基及酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇大量累積,從而可能對其細(xì)胞造成傷害[8-10]。研究表明,狗牙根在水淹環(huán)境下表現(xiàn)出較高的抗氧化組分水平及乙醇脫氫酶活性,可有效地降低水淹環(huán)境對其細(xì)胞傷害[11-12]。水淹生境下誘發(fā)植物形成通氣組織及抗氧化水平上調(diào)等適應(yīng)性機(jī)制均與抗逆基因的表達(dá)有關(guān)[13-14]??鼓婊虮磉_(dá)有賴于參與逆境調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及TF表達(dá),故研究水淹生境下狗牙根的TF表達(dá)特性對揭示植物耐水淹機(jī)制具有重要意義?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)采取實(shí)地水淹處理,基于轉(zhuǎn)錄組分析研究水淹生境下狗牙根參與抗水淹響應(yīng)的TF表達(dá)特性?!緮M解決的關(guān)鍵問題】以期為狗牙根抗水淹分子機(jī)制的探索提供基礎(chǔ),并為后續(xù)的耐淹植物篩選及育種等提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    三峽庫區(qū)消落帶適生狗牙根取自重慶市萬州區(qū)新田鎮(zhèn)譚紹村的消落帶適生植物篩選示范基地。取長勢一致的當(dāng)年生分蘗苗分別作水淹處理,水淹深度30 cm為處理組(A2),未水淹為對照組(A1)。處理組水淹15 d,狗牙根已發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化,同時取A1和A2組狗牙根地下莖為樣本,設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

    1.2 測序樣品的制備及測序

    按照Takara RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue提供的操作流程提取樣品的總RNA,并通過Nanodrop 分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的濃度和質(zhì)量。提取的總RNA經(jīng)過ploy (T)磁珠富集純化mRNA,加Fragmentation Buffer隨機(jī)打斷mRNA,以隨機(jī)引物和發(fā)轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH及DNA聚合酶合成cDNA第二鏈。純化cDNA后作末端修復(fù),末端加A并連接測序接頭,電泳篩選一定大小的片段建庫并基于Illumina HiSeq 4000 測序。

    1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

    測序所得的raw reads經(jīng)過去除低質(zhì)量片段、短片段、接頭污染以及未知堿基含量過高的片段后得到clean read,利用Trinity組裝Unigene,并通過與Nr、Nt、Swissprot、KEGG、COG、Interpro和GO數(shù)據(jù)庫比對注釋Unigenes,未能注釋的Unigene用ESTScan作CDS 預(yù)測。利用Hmmsearch 將Unigene的ORF比對到PlntfDB預(yù)測TF(TF)?;赗SEM計算A1和A2樣品的TF表達(dá)水平,用PossionDis法檢測差異表達(dá)TF,篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change≥ 2.00 和FDR≤0.001。

    1.4 實(shí)時定量 PCR分析

    挑選4個差異表達(dá)TF基因作實(shí)時定量 PCR分析驗(yàn)證。取測序植物樣品按照康為世紀(jì)公司HiFiScript cDNA synthesis kit提供的流程提取RNA及反轉(zhuǎn)錄。選用GAPDH基因作為內(nèi)參,擴(kuò)增所用引物如表1,按照康為世紀(jì)公司Ultra SYBR Mix Kit提供流程,利用Bio-Rad CFX connect Q-PCR作實(shí)時定量 PCR分析。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃保持10 min; 95 ℃保持15 s,60 ℃保持1 min,設(shè)置40次循環(huán)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 測序結(jié)果及Unigene的功能注釋

    A1和A2共獲得22.11 G的原始數(shù)據(jù),經(jīng)數(shù)據(jù)過濾及去冗余后共獲得147 256條總Unigene,其中A1和A2的Unigene數(shù)目分別為128 031和83 363。將得到的總Unigene分別作Nr、Nt、Swissprot、KEGG、COG、Interpro和GO注釋,7個數(shù)據(jù)庫可注釋總Unigene數(shù)目的72.84 %。按照NR、SwissProt、KEGG、COG的優(yōu)先次序,選擇Unigene的最佳比對片段作為其CDS。未注釋的總Unigene基于ESTScan作CDS預(yù)測,Blast和ESTScan可分別預(yù)測94 849和8135條Unigene,將結(jié)果作為該Unigene的參考注釋。

    表1 實(shí)時定量 PCR 選用基因及其引物Table 1 Genes and primers for qRT-PCR

    2.2 狗牙根響應(yīng)水淹脅迫的TF家族及數(shù)目

    對具有編碼TF能力的總Unigene進(jìn)行預(yù)測,并按照TF家族進(jìn)行分類(圖1)。預(yù)測結(jié)果顯示,具有TF編碼能力的Unigene屬于62個TF家族,共2928條TF。預(yù)測數(shù)目較多的TF家族均與植物的抗逆有關(guān),如MYB、MYB-related、bHLH、AP2-EREBP、NAC和WRKY等,這些家族可能參與狗牙根對水淹脅迫的形態(tài)學(xué)發(fā)育和生理代謝改變響應(yīng)。

    2.3 狗牙根響應(yīng)水淹脅迫的TF表達(dá)水平變化

    基于PossionDis法狗牙根在水淹生境下的差異表達(dá)TF基因,以log2FoldChange表示差異倍數(shù),共篩選出屬于54個家族的差異表達(dá)TF 785條,共27個家族的348條TF上調(diào)表達(dá),34個家族的437條TF下調(diào)表達(dá)(表2)。其中,WRKY、bHLH、MYB、AP2-EREBP、MYB-related、Trihelix、NAC、MADS和TCP等9個家族是差異表達(dá)基因數(shù)量最多且表達(dá)量變化幅度最顯著的TF家族,共包含430條差異表達(dá)TF,占總差異表達(dá)總TF的54.78 %,其中上調(diào)表達(dá)189條,下調(diào)表達(dá)241條。9個家族中,除TCP和Trihelix家族外,其他TF家族對狗牙根水淹脅迫的響應(yīng)表達(dá)呈明顯下調(diào),而9個TF家族對狗牙根水淹脅迫的響應(yīng)表達(dá)均呈明顯上調(diào)(表3)。

    2.4 實(shí)時定量PCR分析驗(yàn)證

    分別從WRKY、bHLH、MYB和AP2-EREBP等4個TF家族挑選表達(dá)差異表達(dá)倍數(shù)較大的基因作實(shí)時定量PCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參基因,用2△△Ct表示檢測到的基因表達(dá)量,每個檢測基因設(shè)置3次生物重復(fù)。后期數(shù)據(jù)處理中將轉(zhuǎn)錄組和熒光定量PCR檢測到的某一個基因表達(dá)量變化分別用log2-ratio表示,其中l(wèi)og2-ratio=log2[處理組表達(dá)量/對照組表達(dá)量]?;赟PSS 22.0分析轉(zhuǎn)錄組和實(shí)時定量PCR檢測的差異表達(dá)基因log2-ratio,結(jié)果顯示爾遜相關(guān)系數(shù)為0.8748,P<0.012,表明轉(zhuǎn)錄組分析的差異基因表達(dá)情況較為可靠(圖2)。

    3 小結(jié)與討論

    缺氧和光線不足是深水淹對植物的主要脅迫作用,如缺氧環(huán)境會破壞植物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)而導(dǎo)致活性氧自由基等在植物細(xì)胞內(nèi)累積而引發(fā)膜脂過氧化反應(yīng),及誘發(fā)植物進(jìn)行無氧代謝而導(dǎo)致乙醇等細(xì)胞毒害作用物質(zhì)的產(chǎn)生。此外,深水淹生境下,由于氧氣不足也會引起植物體內(nèi)貯存物質(zhì)的減少,而光照不足導(dǎo)致光合效率低下,使得植物體內(nèi)碳水化合物等不能及時補(bǔ)充。植物對深水淹的適應(yīng)性機(jī)制包括形成不定根和通氣組織、下調(diào)代謝速率、提高弱光利用能力和上調(diào)還原性組分水平等。

    表2 狗牙根響應(yīng)水淹脅迫的差異表達(dá)TF數(shù)量及變化范圍Table 2 Number and range of differentially expressed TFs in response to flooding stress of bermudagrass

    表3 9個數(shù)目最多的差異表達(dá)TF家族Table 3 Nine of the largest number of differentially expressed transcription factor families

    圖2 差異表達(dá)基因的實(shí)時定量PCR分析驗(yàn)證Fig.2 Validation of DEGs by real-time qRT-PCR

    TF在植物抗水淹脅迫應(yīng)答中有著重要作用,已有研究表明,WRKY、bHLH、MYB、HSF、AP2-EREBP、MYB-related和NAC等家族的TF參與植物的抗逆響應(yīng),不同TF表達(dá)水平的變化與植物的脅迫耐受有關(guān)。本研究表明,水淹脅迫會誘導(dǎo)狗牙根多個家族的TF表達(dá)水平發(fā)生顯著變化,相同TF家族中的不同TF表達(dá)上調(diào)或下調(diào),這些TF的種類及表達(dá)水平的變化可能與狗牙根對水淹脅迫響應(yīng)的形態(tài)發(fā)育及代謝改變等適應(yīng)性機(jī)制有關(guān)。研究表明,WRKY、家族TF參與植物生長發(fā)育、損傷修復(fù)及水淹等非生物脅迫等[15]。本研究發(fā)現(xiàn)WRKYTF家族中有13條上調(diào)表達(dá),116條下調(diào)表達(dá),富集數(shù)量較多,顯示該TF家族的不同成員在狗牙根抗水鹽脅迫中可能同時調(diào)控多種抗逆基因表達(dá)。bHLH、MYB、AP2-EREBP、MYB-related和Trihelix等家族的TF也廣泛參與植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)這些TF家族均在狗牙根水淹脅迫中差異表達(dá)基因數(shù)目較多且表達(dá)量變化明顯,這可能也與狗牙根對水淹脅迫的多種適應(yīng)性機(jī)制有關(guān)。NAC、MADS和TCP等家族的轉(zhuǎn)錄TF主要與非生物脅迫中植物的通氣組織形成和不定根發(fā)育等形態(tài)學(xué)改變有關(guān),這種形態(tài)學(xué)改變可增加水淹等脅迫中細(xì)胞的獲氧能力[18-20]。上述9個TF家族富集顯著,顯示這些TF可能參與水淹生境下狗牙根的通氣組織形成及不定根的發(fā)育等形態(tài)學(xué)改變。

    植物通過形態(tài)學(xué)及生理代謝等改變對水淹脅迫作出響應(yīng),該過程由多個基因組成,其調(diào)控與多個TF的家族成員有關(guān)。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析研究了狗牙根對水淹脅迫的TF響應(yīng),為進(jìn)一步了解狗牙根對水淹的適應(yīng)性機(jī)制提供基礎(chǔ),也為植物的耐水淹研究提供基因資源。

    [1]Wang J, Xiang W, Lu N. Landsliding triggered by reservoir operation:a general conceptual model with a case study at Three Gorges Reservoir[J]. Acta Geotechnica, 2014, 9(5):771-788.

    [2]Bao Y, Tang Q, He X, et al. Soil erosion in the riparian zone of the Three Gorges Reservoir, China[J]. Hydrology Research, 2015, 46(2):212-221.

    [3]馬 駿,李昌曉,魏 虹,等. 三峽庫區(qū)生態(tài)脆弱性評價[J]. 生態(tài)學(xué)報,2015,35(21):7117-7129.

    [4]Liao J, Jiang M, Li L. Effects of simulated submergence on survival and recovery growth of three species in water fluctuation zone of the Three Gorges reservoir[J]. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(4):216-220.

    [5]Zhang W, Liu J, Xia H, et al. Carbon dioxide exchange flux of bermudagrass[Cynodondactylon(linn.)pers.]from the water-level-fluctuate-zone of Three Gorges Reservoir, China[J]. Advances in Earth & Environmental Sciences, 2013, 189:931-939.

    [6]Fan D Y, Xiong G M, Zhang A Y, et al. Effect of water-lever regulation on species selection for ecological restoration practice in the water-level fluctuation zone of Three Gorges Reservoir[J]. Abstracts in Anthropology, 2015, 39(4):416-432.

    [7]Tan S, Zhu M, Zhang Q. Physiological responses of bermudagrass (Cynodondactylon) to submergence[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2010, 32(1):133-140.

    [8]U BB, Yong C, Zou X L, et al. Ethanol content in plants ofBrassicanapusL. correlated with waterlogging tolerance index and regulated by lactate dehydrogenase and citrate synthase[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2016, 38(3):1-9.

    [9]Xu X, Wang H, Qi X, et al. Waterlogging-induced increase in fermentation and related gene expression in the root of cucumber (CucumissativusL.)[J]. Scientia Horticulturae, 2014, 179:388-395.

    [10]Yu M, Zhou Z, Deng X, et al. Physiological mechanism of programmed cell death aggravation and acceleration in wheat endosperm cells caused by waterlogging[J].Acta Physiologiae Plantarum, 2017, 39(1):1-5.

    [11]Ye T, Shi H, Wang Y, et al. Contrasting Changes Caused by Drought and Submergence Stresses in Bermudagrass (Cynodondactylon)[J].Frontiers in Plant Science, 2015(6):951-956.

    [12]張志永,程 麗,李春輝,等. 三峽水庫淹沒水深對消落帶植物牛鞭草和狗牙根生長及抗氧化酶活性的影響[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志,2016,37(3):49-55.

    [13]Pramanik M, Shelley I J, Adhikary D, et al. Carbohydrate reserve and aerenchyma formation enhance submergence tolerance in rice[J]. Progressive Agriculture,2016, 27(3):256-264.

    [14]Yamauchi T, Shimamura S, Nakazono M, et al. Aerenchyma formation in crop species:A review[J]. Field Crops Research, 2013, 152(10):8-16.

    [15]Liyun L, Jianan S, Shuo Y, et al. Functional annotation of rice WRKY transcription factors based on their transcriptional features[J]. Hereditas, 2016, 38(2):126-136.

    [16]Du H, Huang M, Zhang Z, et al. Genome-wide analysis of the AP2/ERF gene family in maize waterlogging stress response[J]. Euphytica, 2014, 198(1):115-126.

    [17]Thirunavukkarasu N, Hossain F, Mohan S, et al. Genome-Wide Expression of Transcriptomes and Their Co-Expression Pattern in Subtropical Maize(ZeamaysL.) under Waterlogging Stress[J]. Plos One, 2013, 8(8):e70433.

    [18]Hofmann N R. A NAC transcription factor for flooding:SHYG helps plants keep their leaves in the air[J]. Plant Cell, 2013, 25(12):4771-4771.

    [19]Nicolas M, Cubas P. TCP factors:new kids on the signaling block[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2016, 33:33-41.

    [20]Ryan P R, Delhaize E, Watt M, et al. Plant roots:understanding structure and function in an ocean of complexity[J]. Annals of Botany, 2016, 118(4):555-559.

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