圓齒野鴉椿醇提物抗肝癌作用研究△

黃維，鄒小興，丁卉，梁文賢，倪林，鄒雙全*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002）

圓齒野鴉椿Euscaphis konishii Hayata為省沽油科（Staphyleaceae）野鴉椿屬 （Euscaphis）常綠小喬木［1-2］。在民間，圓齒野鴉椿的根、根皮、花、果實均可作藥用，具有溫中理氣、抗炎鎮(zhèn)痛、清熱解毒、消腫散結(jié)等功效，常用來治療胃痛、寒疝、瀉痢、脫肛、子宮下垂、睪丸腫痛、跌打損傷等疾病［2-4］。目前，國內(nèi)外對圓齒野鴉椿的研究主要集中在組織培養(yǎng)、種子發(fā)芽、栽培技術(shù)等方面［5-7］，而圓齒野鴉椿化學(xué)成分及其藥理藥效活性等研究尚屬空白，相關(guān)的報道也僅是對同屬植物野鴉椿的提取物在消炎、抗癌等方面的初步研究［8-10］。本研究通過制備圓齒野鴉椿不同部位的乙醇提取物，采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）和流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞凋亡的體外實驗、小鼠肝癌H22移植瘤體內(nèi)抑瘤實驗，探討圓齒野鴉椿不同部位提取物的抗肝癌效果，該研究可為今后對圓齒野鴉椿的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 植物

圓齒野鴉椿于2016年10月采自福建省邵武市天成巖，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)鄒雙全教授鑒定為省沽油科野鴉椿屬圓齒野鴉椿Euscaphis konishii Hayata。圓齒野鴉椿果實曬干后分離果皮和種子；取頂端去葉枝條，長度為40～50 cm；取頂端枝條上當(dāng)年生葉片。

1.2 試劑

5-氟尿嘧啶（5-Fu）質(zhì)量分?jǐn)?shù) ＞99%（sigma公司）。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶和0.01 mol·L-1PBS溶液（Hyclone公司）；四甲基偶氮唑鹽 MTT（Amresco公司），Annexin V-FITC／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（KGA106，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）及其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），倒置顯微鏡（日本Olympus），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma），TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），超凈工作臺（蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司），酶標(biāo)儀（美國BioTek），F(xiàn)ACSC autoTMⅡ型流式細(xì)胞儀（美國BD）。

1.4 細(xì)胞株

HepG2、SMMC-7721和BEL-7404肝癌細(xì)胞，小鼠H22肝癌細(xì)胞株，均購自上海細(xì)胞微生物研究所。

1.5 動物

普通級昆明種小鼠，體重18～22 g，均為雄性小鼠，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（閩）2016-0007。

2 方法

2.1 圓齒野鴉椿醇提物的制備

取干燥的圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加50 L體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇加熱至80℃回流提取2次，每次提取2 h，合并提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，干燥，得圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子的醇提物。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2、SMMC-7721和BEL-7404肝癌細(xì)胞培養(yǎng)條件為含有胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)為0.1）、青霉素（1×105IU·L-1）和鏈霉素（100 mg·L-1）的 RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.3 MTT法測定藥物的半數(shù)抑制濃度

在96孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞，每孔接種量為5×103個細(xì)胞，每孔180μL，實驗組分別加入不同濃度的藥物，對照組不加藥，另設(shè)空白孔組（只加培養(yǎng)基，無細(xì)胞），每組設(shè)3個平行孔，37℃培養(yǎng)至所需的時間，加入5 g·L-1的MTT溶液20μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，加入150μL DMSO溶解，培養(yǎng)箱孵育20 min后，用酶標(biāo)儀（Thermo公司）在570 nm波長下測吸光度值（A）。根據(jù)公式（1）計算細(xì)胞生長抑制率。

以同一藥物的不同濃度對細(xì)胞生長抑制率作圖，可得到劑量反應(yīng)曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥的半數(shù)抑制濃度IC50，即細(xì)胞存活率減少50%時的藥物濃度。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用200μg·mL-1果皮、葉片、枝條和種子的乙醇提取物處理細(xì)胞48 h后，調(diào)整密度為1～5×105mL-1細(xì)胞懸液，用PBS洗2遍，再將細(xì)胞重懸于Binding Buffer懸浮細(xì)胞。設(shè)置陰性對照和兩個單染對照。陰性對照為對照組細(xì)胞不加染料，兩個單染對照為陽性藥物處理過的細(xì)胞只加入5μL Annexin V-FITC或5μL PI。測試組細(xì)胞加入 Annexin V-FITC混勻后，再加入5μL PI混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15 min。在1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測。流式細(xì)胞儀采集的熒光強度用自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.5 小鼠肝癌H22移植瘤模型的建立

接種H22瘤種腹腔傳代6～8 d后，腹部隆起明顯，將腹水瘤小鼠以脫頸法處死，無菌條件下從腹腔抽出瘤液，用0.9%氯化鈉注射液稀釋至1×107個·mL-1，采用該濃度腫瘤細(xì)胞懸液對實驗小鼠右腋進(jìn)行皮下接種，接種量為0.2 mL／只，構(gòu)建小鼠肝癌H22移植瘤模型。

2.6 動物分組和給藥

接種24 h后，將小鼠隨機分為6組，每組10只。模型組灌胃給予0.9%氯化鈉注射液，陽性組給予5-Fu 20 mg·kg-1，給藥組分別給予圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子的醇提物200 mg·kg-1，用0.9%氯化鈉注射液配成混懸液進(jìn)行給藥，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

2.7 組織樣品的收集與處理

末次給藥24 h后稱小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死動物，剝離瘤塊，剖取胸腺、脾臟，用濾紙吸干后稱重并記錄。分別按公式（2）（3）（4）計算各組的腫瘤抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以（ˉx±s）表示，多組間比較采用完全隨機設(shè)計方差分析（ANOVA），組間比較采用 LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 圓齒野鴉椿各部位的醇提物的制備

圓齒野鴉椿果皮、葉片、枝條和種子經(jīng)過烘干粉碎后，各取10 kg樣品采用70%乙醇回流提取2次，提取液過濾后，減壓濃縮分別得到圓齒野鴉椿果皮、葉片、枝條和種子的醇提物2.65、2.37、2.42、2.25 kg。

3.2 圓齒野鴉椿各部位的醇提物對肝癌細(xì)胞增殖的抑制

取上述圓齒野鴉椿果皮、葉片、枝條和種子醇提物，以 DMSO配制，分別處理 HepG2、SMMC-7721和BEL-7404肝癌細(xì)胞48 h，用 MTT法檢測上述醇提物對肝癌細(xì)胞增殖的影響，以同一藥物的不同濃度對細(xì)胞生長抑制率做圖，得到劑量反應(yīng)曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥的半數(shù)抑制濃度IC50，即細(xì)胞存活率減少50%時的藥物濃度。果皮醇提物、枝條醇提物、葉片醇提物和種子醇提物對 HepG2、SMMC-7721和 BEL-7404的IC50見表1。結(jié)果表明，圓齒野鴉椿各提取物對肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7404均有明顯的增殖抑制作用，其中果皮提取物的抑制作用最為明顯。

表1 圓齒野鴉椿各部位醇提物對HepG2、SMMC-7721和BEL-7404細(xì)胞的IC50（ˉx±s，n＝3）μg·mL-1

3.3 圓齒野鴉椿各部位醇提物對HepG2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用

200μg·mL-1圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子的乙醇提取物處理 HepG2細(xì)胞48 h，以20μg·mL-15-Fu為陽性對照，用流式細(xì)胞儀檢測，果皮、枝條、葉片和種子醇提物誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞早期凋亡率分別為 10.27%、9.73%、9.35%、8.63%，晚期凋亡率分別為 9.55%、8.94%、6.73%、5.27%，與空白對照組相比，均可顯著引起HepG2細(xì)胞凋亡（P＜0.05，見圖1和表2），而果皮提取的凋亡誘導(dǎo)效果最好。

圖1 圓齒野鴉椿各部位醇提物對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

表2 200μg·m L-1圓齒野鴉椿各部位醇提物對HepG2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用（±s，n＝3）

表2 200μg·m L-1圓齒野鴉椿各部位醇提物對HepG2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用（±s，n＝3）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

表3 圓齒野鴉椿各部位醇提物對小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用（ˉx±s，n＝10）

3.4 圓齒野鴉椿各部位醇提物對小鼠肝癌H22移植瘤體內(nèi)抑瘤效果的研究

用小鼠肝癌H22移植瘤模型來考察圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子的乙醇提取物的體內(nèi)抗腫瘤活性。取圓齒野鴉椿各部分提取物200 mg·kg-1，對肝癌H22移植瘤小鼠連續(xù)灌胃給藥14 d，以5-Fu 20mg·kg-1為陽性對照，以0.9%氯化鈉注射液給模型組，于第15 d稱體重，頸椎脫臼處死動物，剝離瘤塊，計算圓齒野鴉椿各部分醇提物的抑瘤率。

表3、圖2結(jié)果顯示，圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子的乙醇提取物200 mg·kg-1連續(xù)灌胃給藥14 d，對肝癌H22移植瘤小鼠瘤塊增殖的抑制率可分別達(dá)到47.8%、44.9%、42.5%和40.6%，顯示了良好的體內(nèi)抗肝癌活性。

圖2 圓齒野鴉椿各部位醇提物對小鼠肝癌H22移植瘤生長的作用效果

3.5 圓齒野鴉椿各部位醇提物對H22小鼠免疫器官的影響

5-Fu組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯小于正常組和模型組（P＜0.01），而圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子醇提物給藥組小鼠的胸腺指數(shù)與正常組和模型組相比，有明顯的提高（P＜0.05），而對脾臟指數(shù)無影響（P＞0.05，見表4），說明圓齒野鴉椿各部分醇提物對荷瘤小鼠具有一定的免疫增強作用。

表4 圓齒野鴉椿各部位醇提物對H22小鼠免疫器官的影響（ˉx±s，n＝10）

4 討論

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一，我國每年約有38.3萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%，嚴(yán)峻的形勢對國人的健康和社會經(jīng)濟帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。采用化學(xué)合成藥物來治療癌癥，療效顯著，但是具有較高的毒副作用，容易產(chǎn)生耐藥性，且停藥后有 “反跳”現(xiàn)象，治療效果有限。中藥作為天然產(chǎn)物，具有不良反應(yīng)小、遺傳毒性低等優(yōu)點。因此，中藥抗癌藥物的研發(fā)一直受到關(guān)注。野鴉椿屬植物野鴉椿在消炎和抗癌方面有顯著的體外療效［13-16］，但目前尚未有圓齒野鴉椿抗肝癌研究的報道。

本研究通過制備圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子的乙醇提取物，通過MTT法檢測這4種醇提物對3株人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7404有不同程度的增殖抑制作用，其中果皮醇提物的抑制效果最強，對上述3株肝癌細(xì)胞作用48 h的半數(shù)抑制濃度分別為108.34、106.94、114.79μg·mL-1。我們進(jìn)一步觀察了圓齒野鴉椿不同部位醇提物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的效果，結(jié)果顯示，當(dāng)這4種醇提物濃度為200μg·mL-1處理HepG2細(xì)胞48 h后，均可顯著引起HepG2細(xì)胞的凋亡，其中果皮醇提物的活性最好。在體內(nèi)活性檢測中，圓齒野鴉椿果皮、枝條、葉片和種子的乙醇提取物200 mg·kg-1對小鼠肝癌H22移植瘤小鼠瘤塊增殖的抑制率分別達(dá)到47.8%、44.9%、42.5%和40.6%，顯示了良好的體內(nèi)抗肝癌活性。同時，對H22移植瘤小鼠進(jìn)行解剖時發(fā)現(xiàn)，圓齒野鴉椿醇提物處理的H22小鼠腫瘤浸潤范圍較小，瘤塊較易剝離，而與傳統(tǒng)的化療藥5-Fu相比，圓齒野鴉椿醇提物的抑制腫瘤生長作用雖有所不及，但對荷瘤小鼠的體重影響較小，各部位醇提物給藥組的胸腺指數(shù)均高于正常組和模型組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明圓齒野鴉椿醇提物具有明顯的抗肝癌活性，可以提高腫瘤小鼠的免疫功能，值得深入研究其抗腫瘤的成分或有效組分。

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