基于人工胃酸水解的黃芪糖指紋圖譜的建立及不同種質(zhì)資源黃芪鑒別△

李曉霞，王迪，王桂臻，劉磊，李震宇，秦雪梅，李科*

（1.山西省果業(yè)工作總站，山西 太原 030001；2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；3.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006）

黃芪，作為我國(guó)傳統(tǒng)的珍貴補(bǔ)益藥材之一，使用歷史已有2000多年，素有 “十方八芪”之說(shuō)。中華人民共和國(guó)藥典（2010版）規(guī)定，黃芪為豆科草本植物黃芪屬蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪 A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根［1］。本品具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、斂瘡生肌等功效［2］，用于氣虛乏力，食少便溏［3］，是一種常見(jiàn)的補(bǔ)益中藥。黃芪的主要化學(xué)成分包括黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、黃芪多糖、氨基酸等多種成分［4］。其中，黃芪多糖具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、促進(jìn)抗體生成、促進(jìn)免疫、雙向調(diào)節(jié)血糖和保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用［5-8］，是黃芪發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的主要物質(zhì)。然而復(fù)方中藥中黃芪多糖主要經(jīng)口服進(jìn)入胃內(nèi)，在胃酸與胃酶作用下降解為寡糖片段后被吸收利用。這些寡糖化合物分子量分布如何，不同種質(zhì)資源蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖經(jīng)胃酸處理后是否存在差異，這些寡糖如何發(fā)揮活性作用目前尚不清楚。

近年來(lái)關(guān)于體外模擬人工胃液實(shí)驗(yàn)研究較多，如金暉［9］等通過(guò)南瓜多糖在體外模擬人工胃液條件下的水解實(shí)驗(yàn)獲知，隨胃酸與胃酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖的量不斷緩慢增加，HPLC結(jié)果顯示作用30 min時(shí)出現(xiàn)小分子糖，作用90 min時(shí)大分子量多糖出現(xiàn)明顯變化，提示南瓜多糖在體外模擬人工胃液環(huán)境中隨時(shí)間作用會(huì)發(fā)生一定程度的降解，產(chǎn)生還原糖和寡糖片段。陳萍［10］等通過(guò)抗氧化活性較好的茶多糖TPF70在體外模擬人工胃液條件下的水解試驗(yàn)獲知，茶多糖在體外模擬人工胃液環(huán)境中隨時(shí)間作用會(huì)發(fā)生一定程度的降解，產(chǎn)生還原糖和寡糖片段。

因此，本研究模擬人工胃酸條件處理不同種質(zhì)資源蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）細(xì)胞可溶性多糖及糖綴合物，獲得指紋圖譜，分析其降解片段的分子量分布，并用主成分分析找出不同種質(zhì)資源黃芪差異的糖組分。研究結(jié)果不僅為黃芪種質(zhì)資源鑒別提供了方法，而且為降解產(chǎn)生的黃芪活性寡糖篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)所需植物材料包括蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）兩個(gè)種，共24批。購(gòu)買(mǎi)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)。將藥材保存于陰涼、干燥通風(fēng)處。藥材詳細(xì)信息如表1所示。將這24批不同種質(zhì)資源的黃芪藥材分別粉碎得到細(xì)粉，備用。

表1 黃芪樣本信息

1.2 儀器與試劑

DYY-10C型電泳儀電源，DY-C7型電泳儀（北京市六一儀器廠）；真空冷凍干燥儀（ZD-A1L）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A；高速冷凍離心機(jī)（寧波新芝科技有限公司TGL-16型）。

葡萄糖、麥芽糖、棉子糖、麥芽四聚糖、麥芽五聚糖和麥芽六聚糖標(biāo)準(zhǔn)品；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、8-氨基萘-1，3，6-三磺酸（ANTS）、NaCNBH3、丙烯酰胺（Acrylamide）、N，N-亞甲基二丙烯酰胺（Bisacrylamide）、尿素（Urea）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸（H3BO3）、過(guò)硫酸銨（AP）、乙醇等均為分析純；人工胃酸。

1.3 方法

1.3.1 黃芪多糖的提取和純化

（1）提取粗多糖將干燥的蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）粉碎成粉末，過(guò)100目篩，取黃芪細(xì)粉約5 g，精密稱(chēng)定后置于1000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL（1∶100），100℃回流提取1 h，降至室溫后離心取上清液。殘?jiān)偌铀?00mL（料液比1∶80），重復(fù)提取1次，取上清，合并上清。濃縮，用95%的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80%。3000 r·min-1離心10min。合并沉淀，冷凍干燥的多糖粗粉。

（2）純化多糖 將上一步驟得到的多糖粗粉溶于水中，加入各10%體積的10.6%的亞鐵氰化鉀溶液和21.9%的乙酸鋅溶液，振搖后靜置30 min，離心得到純化多糖，凍干，備用。

1.3.2 人工胃液的配制 參照2010年版 《中國(guó)藥典》規(guī)定，取稀鹽酸16.4 mL，加約800 mL水及胃蛋白酶10 g，搖勻后加水稀釋成1000 mL，即得。

1.3.3 黃芪多糖的酸解和衍生化 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖約5 mg，置于10 mL具塞玻璃管中，分別用人工胃酸2 mL對(duì)四種多糖進(jìn)行酸解，然后根據(jù)最優(yōu)降解條件，40℃搖床孵育1 h，置于80℃水浴上滅活20 min，離心（3000 r·min-1，5 min），去上清，氮?dú)獯蹈伞⑺峤猱a(chǎn)物溶于200μL的NaCNBH3溶液中，加入200μL的ANTS衍生化試劑，37℃搖床孵育15 h后，將產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶? mL的6 mol·L-1的尿素溶液，備用。

1.3.4 黃芪多糖和糖標(biāo)準(zhǔn)品酸解產(chǎn)物電泳分析 采用垂直板凝膠電泳分離糖標(biāo)準(zhǔn)品及黃芪多糖部分酸解衍生化產(chǎn)物，分離膠和濃縮膠分別為0.1 moL·L-1Tris-H3BO3（pH＝8.2）溶液配制的30 g·（100 mL）-1和8 g·（100 mL）-1的聚丙烯酰胺凝膠。電泳緩沖液為0.1～0.2 moL·L-1Tris-H3BO3（pH＝8.2）。上樣量為1～3μL，以溴酚藍(lán)為前沿指示劑，首先采用80 V電壓進(jìn)行電泳分離60 min，隨后采用200V電壓進(jìn)行電泳分離120 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 將電泳圖導(dǎo)入Quantity One軟件，經(jīng)過(guò)扣除背景、手動(dòng)校正、基線(xiàn)校準(zhǔn)等處理后，得到色譜圖。色譜圖轉(zhuǎn)化為Excel數(shù)據(jù)后導(dǎo)入SMICA-P 13.0進(jìn)行分析，然后運(yùn)用代謝組學(xué)分析技術(shù)尋找差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖酸解產(chǎn)物的電泳指紋圖譜

圖1 黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物的PACE指紋圖譜分析圖

2.2 黃芪多糖降解后黃芪寡糖的分子量分布分析

由黃芪多糖部分酸解衍生化產(chǎn)物電泳的Rf值，根據(jù)PACE電泳后六種糖標(biāo)準(zhǔn)品的Rf-分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖2），推出黃芪多糖降解后黃芪寡糖相應(yīng)的分子量。分子量與Rf值分布如下圖2。

圖2 葡萄糖、麥芽糖、棉子糖、麥芽四聚糖、麥芽五聚糖和麥芽六聚糖標(biāo)準(zhǔn)品電泳后Rf-分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）四組多糖酸解產(chǎn)物的電泳指紋圖譜多元統(tǒng)計(jì)分析

圖3中A為蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜PCA得分散點(diǎn)圖，可見(jiàn)，蒙古芪與膜莢芪可得到較好分離，蒙古移栽芪和野生芪分離明顯，膜莢移栽芪和野生芪分離不明顯。進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA分析（見(jiàn)圖3-B）發(fā)現(xiàn)與PCA圖基本一致，模型參數(shù)為R2＝0.425，Q2＝-0.639。用外部模型驗(yàn)證方法排列實(shí)驗(yàn)來(lái)證明模型成立（見(jiàn)圖3-C），載荷圖分析（見(jiàn)圖3-D）可以繼續(xù)后面部分差異成分的篩選。

圖3 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的多元統(tǒng)計(jì)分析

從A圖分析，蒙古黃芪和膜莢黃芪種屬之間的差異要大于移栽和野生生長(zhǎng)方式間差異，野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪分離現(xiàn)象明顯，移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪分離現(xiàn)象明顯，可以對(duì)同一生長(zhǎng)方式不同種屬黃芪進(jìn)行差異性片段尋找；膜莢黃芪中移栽芪和野生芪分離現(xiàn)象不明顯，尋找差異性片段意義不大；蒙古黃芪中移栽芪和野生芪能得到很好的分離，對(duì)區(qū)分蒙古黃芪移栽和野生的差異性片段進(jìn)行篩選。

2.4 篩選野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性生物標(biāo)志物

圖4中A為野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪多糖酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜OPLS-DA散點(diǎn)圖，可見(jiàn)，野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪可得到較好分離。用外部模型驗(yàn)證方法排列實(shí)驗(yàn)來(lái)證明模型成立（見(jiàn)圖4-B），載荷圖分析（見(jiàn)圖4-C）可以進(jìn)行差異成分的篩選。

由圖分析可知，三糖和四糖可以作為區(qū)分野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪的主要差異性片段。對(duì)該片段分析發(fā)現(xiàn)，野生膜莢黃芪中三糖和四糖的含量均高于野生蒙古黃芪的含量。

2.5 篩選移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性生物標(biāo)志物

圖6中A為移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪多糖酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜OPLS-DA散點(diǎn)圖，可見(jiàn)，野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪可得到較好分離。用外部模型驗(yàn)證方法排列實(shí)驗(yàn)來(lái)證明模型成立（見(jiàn)圖6-B），載荷圖分析（見(jiàn)圖6-C）可以進(jìn)行差異成分的篩選。

圖4 野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的多元統(tǒng)計(jì)分析

圖5 野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性糖片段個(gè)數(shù)（A）和糖片段柱狀圖（B）

圖6 移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的多元統(tǒng)計(jì)分析

由圖分析可知，五糖和六糖可以作為區(qū)分移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪的主要差異性片段。對(duì)該片段分析發(fā)現(xiàn)，移栽膜莢黃芪中五糖和六糖的含量均高于移栽蒙古黃芪的含量。

2.6 篩選蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性生物標(biāo)志物

圖8，為了明確蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物間的化學(xué)差異成分，分組對(duì)酸解產(chǎn)物的電泳指紋圖譜進(jìn)行OPLS-DA、模型驗(yàn)證及載荷圖分析，篩選生物標(biāo)志物。

蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的OPLS-DA分析結(jié)果見(jiàn)圖8。圖8A顯示野生和移栽黃芪多糖酸水解產(chǎn)物得到很明顯的分離，其中野生芪位于散點(diǎn)圖的右部，而移栽芪位于散點(diǎn)圖的左部，表明它們之間存在較大的差異。圖8B模型驗(yàn)證采用總解釋變量（R2值）和模型可預(yù)測(cè)性（Q2值）進(jìn)行評(píng)估。回歸線(xiàn)縱軸相交并處于零點(diǎn)以下，左端任何一次隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2、Q2均小于右端，且最右端的兩個(gè)值差距較小。表明模型具有良好的可預(yù)測(cè)性和擬合度。模型驗(yàn)證結(jié)果成立，模型可靠。通過(guò)相應(yīng)的載荷圖中距原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)篩選具有潛在貢獻(xiàn)的生物標(biāo)志物（VIP＞1）（圖8C）。

圖7 移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性糖片段個(gè)數(shù)（A）和糖片段柱狀圖（B）

圖8 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的OPLS-DA散點(diǎn)圖（A），模型交叉驗(yàn)證圖（B）及Loading圖（C）

圖9 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性糖片段個(gè)數(shù)（A）和糖片段柱狀圖（B）

由圖分析可知，四糖和六糖可以作為區(qū)分蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）生長(zhǎng)方式的主要差異性片段。對(duì)該片段分析發(fā)現(xiàn)，野生蒙古黃芪中四糖的含量高于移栽蒙古黃芪含量，移栽蒙古黃芪六糖的含量高于野生蒙古黃芪含量。

3 討論與結(jié)論

在本研究中，野生黃芪選自道地產(chǎn)區(qū)山西渾源等地，這些地方多是土質(zhì)疏松的半坡環(huán)境，夏季日照充足，干旱少雨，晝夜溫差大，冬季寒冷，野生黃芪在此環(huán)境中生長(zhǎng)多達(dá)5年以上。移栽黃芪則是農(nóng)戶(hù)選擇肥沃土地，經(jīng)移栽施肥生長(zhǎng)2年后采收。相比之下，野生黃芪受到了更多干旱、低溫、營(yíng)養(yǎng)缺乏等環(huán)境脅迫，而移栽黃芪較少受到逆境的影響。大量研究表明，植物通常以細(xì)胞和整個(gè)生物有機(jī)體抵抗脅迫。逆境下，植物會(huì)在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、滲透調(diào)節(jié)、植物激素水平、膜保護(hù)物質(zhì)及活性氧平衡、逆境蛋白等諸多環(huán)節(jié)發(fā)生變化，涉及到植物水分、光合、呼吸、物質(zhì)代謝等多項(xiàng)生理過(guò)程［11-15］。已有研究報(bào)道，細(xì)胞質(zhì)中游離糖及糖醇成分是植物受到生長(zhǎng)脅迫而誘導(dǎo)產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)在細(xì)胞中大量積累，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，有利于植物保持水分，抵抗鹽堿、低溫等多種逆境，對(duì)維持植物的正常生理功能具有重要作用［11］。因此，在環(huán)境影響下，野生黃芪比移栽黃芪經(jīng)受更多的脅迫因素，野生黃芪中的多糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于移栽黃芪［16］。雖然本研究找出了四糖和六糖可以作為區(qū)分蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）生長(zhǎng)方式的主要差異性片段，然而多糖經(jīng)人工胃酸水解后的糖片段含量差異，活性如何，是否可以作為評(píng)價(jià)黃芪種質(zhì)資源的指標(biāo)還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體外模擬人工胃液條件測(cè)定人工胃酸對(duì)蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）黃芪多糖的酸解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)基于人工胃酸條件水解能很好的區(qū)分蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）。根據(jù)PACE電泳后六種糖標(biāo)準(zhǔn)品的Rf-分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖2），推出黃芪多糖降解后黃芪寡糖相應(yīng)的分子量及其分布。分析結(jié)果顯示：膜莢黃芪中移栽芪和野生芪分離現(xiàn)象不明顯，尋找差異性片段意義不大，而蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖酸解產(chǎn)物中的四糖和六糖可以作為區(qū)分生長(zhǎng)方式的專(zhuān)屬性糖片段，且野生蒙古黃芪中四糖的含量高于移栽蒙古黃芪含量，移栽蒙古黃芪中六糖的含量高于野生蒙古黃芪含量；三糖和四糖可以作為區(qū)分野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪的主要差異性片段，對(duì)該片段分析發(fā)現(xiàn)，野生膜莢黃芪中三糖和四糖的含量均高于野生蒙古黃芪含量；五糖和六糖可以作為區(qū)分移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪的主要差異性片段，對(duì)該片段分析發(fā)現(xiàn)，移栽膜莢黃芪中五糖和六糖的含量均高于移栽蒙古黃芪含量。這一指標(biāo)為蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）的鑒別提供了依據(jù)，同時(shí)也為黃芪藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

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