西南部分地區(qū)圈養(yǎng)非人靈長類賈第蟲感染情況調(diào)查及多位點(diǎn)基因序列分析

田一男，魏 斌，李 平，黃祥明，李 威，涂 蕊，但佳明，袁 莉，楊亭玉，彭廣能，鐘志軍，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130； 2.邛崍市農(nóng)業(yè)和林業(yè)局，四川 邛崍 611530； 3.成都大熊貓繁育研究基地 四川省瀕危野生動物保護(hù)生物學(xué)省部共建實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610081)

賈第蟲(Giardiaduodenalis)是重要的人獸共患性寄生蟲之一，可感染人、家畜和多種野生動物[1]。人與動物感染賈第蟲后表現(xiàn)的癥狀多樣，包括無明顯臨床表現(xiàn)或腹瀉、脫水、腹痛、嘔吐、體重減輕等急性或慢性癥狀[2]，其輕重程度取決于動物的營養(yǎng)、免疫力以及寄生蟲的毒力等因素。常見的感染方式包括水、食物、糞便等經(jīng)口感染，人與動物接觸以及動物與動物間接觸等，其中多次報道由于水源污染而引發(fā)賈第蟲病暴發(fā)[4-5]。

采用分子分型技術(shù)已鑒定出8個(A-H)賈第蟲集聚體，其中A和B為最常見的人獸共患集聚體，C和D可感染犬、狼等動物，E主要感染牛、羊等家畜，F(xiàn)常感染貓，G和H分別在嚙齒類和海豹等海洋生物中發(fā)現(xiàn)，非人靈長類中主要感染集聚體A和B[6]。

非人靈長類動物作為珍貴野生動物資源以及重要的實(shí)驗(yàn)動物，與人類直接或間接接觸的機(jī)會較多，其中圈養(yǎng)非人靈長類與人接觸的概率更大。本研究選擇bg、tpi和gdh基因，通過巢式PCR擴(kuò)增基因序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析西南部分地區(qū)圈養(yǎng)非人靈長類賈第蟲感染情況及其基因型，對保護(hù)珍貴野生動物以及人類公共健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

糞便DNA提取采用QIAGEN公司的PowerSoil?DNA試劑盒；2×TaqPCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 樣品采集

于2016年3月至5月以及2016年9月至11月期間，在西南部分地區(qū)國家獼猴繁殖實(shí)驗(yàn)基地、貴陽動物園、雅安碧峰峽動物園、成都市高新區(qū)獼猴養(yǎng)殖場、成都動物園等采集非人靈長類新鮮糞便共207份，包括獼猴糞便101份、長臂猿糞便36份、金絲猴糞便9份、食蟹猴糞便60份。每份樣品約50 g，分別用潔凈自封袋裝好、標(biāo)記，樣品置于4 ℃冰箱保存待檢。

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增測序

采用改良飽和蔗糖溶液漂浮法處理207份非人靈長類糞便，按照PowerSoil?DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

bg、tpi和gdh基因引物設(shè)計及擴(kuò)增條件參照Sulaiman等[7]、Appelbee等[8]和Caccio等[9]的報道。反應(yīng)體系為25 μL∶2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、Deionized Water 7.5 μL、0.1%BSA 1.0 μL、上下游引物各1.0 μL、模板DNA 2.0 μL。取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠孔中，在100 V電壓下電泳1 h，然后于凝膠成像系統(tǒng)儀中拍照，擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送華大基因公司測序。測序結(jié)果在GenBank中BLAST比對校正后提交至NCBI。將校正后序列與NCBI上參考序列使用Clustal X比對，然后使用Mega 6的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 西南部分地區(qū)圈養(yǎng)非人靈長類賈第蟲感染情況

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，207份樣品中16份樣品為賈第蟲感染陽性(感染率為7.73%)。其中獼猴、長臂猿、食蟹猴的感染率分別為0.99%(1/101)，38.89%(14/36)，1.67%(1/60)，金絲猴未檢出賈第蟲感染。5個采樣點(diǎn)中僅2個采樣點(diǎn)檢出賈第蟲，分別為貴陽動物園，感染率為30.0%(15/50)，成都市高新區(qū)獼猴養(yǎng)殖場，感染率為1.67%(1/60)。從本次檢測的省份來看，四川地區(qū)非人靈長類賈第蟲感染率為0.64%(1/157)，貴陽地區(qū)非人靈長類賈第蟲感染率為30.0%(15/50)。所有陽性樣品均完成bg、tpi和gdh基因位點(diǎn)擴(kuò)增，經(jīng)鑒定，均為集聚體B。將序列提交至NCBI獲得登錄號分別為KY696790-KY696821。

2.2 基因序列分析

在NCBI中搜索bg、tpi和gdh相關(guān)參考序列，用Mega 6與本次研究所得序列進(jìn)行同源性分析。基于gdh基因位點(diǎn)，16條序列均鑒定為BIV亞型，其中1條與巴西人賈第蟲分離株(GenBank:EF507672)完全一致，其余15條與巴西人賈第蟲分離株(GenBank:EF507682)完全一致。

基于bg基因位點(diǎn)(圖1)，16條序列形成5個基因亞型(GenBank:KY696824、KY696825、KY696828、KY696832、KY696836)，包括已知基因亞型的環(huán)尾狐猴分離株Bb-4(GenBank:KJ888977)、人分離株BIII(GenBank:KF922976)、巴巴利獼猴分離株BIII-1(GenBank:EU637581)、獼猴分離株B1(GenBank:KM211793),以及一個新基因亞型，命名為BIII-2。其中以BIII(n=7)基因亞型為主。

基于tpi基因位點(diǎn)(圖2)，16條序列均鑒定為集聚體B，形成6個亞型，包括已知基因亞型水源分離株B7(GenBank:JQ863259)、山魈分離株WB6(GenBank:KJ888987)、獼猴分離株WB8(GenBank:KF679738)、人分離株EB5(GenBank：KT948110)、人分離株BIV(GenBank:AB18783)，以及一個新基因亞型B9(GenBank:KY696810)。其中WB8(n=7)是最主要的基因亞型。

3 討論

本次調(diào)查，西南部分地區(qū)非人靈長類賈第蟲總感染率為7.73%，高于廣西、秦嶺以及全國范圍內(nèi)非人靈長類賈第蟲感染率(2.4%，2.0%，2.2%和1.3%)[10-13]。本試驗(yàn)中，四川地區(qū)非人靈長類賈第蟲感染率為0.64%，與Li等[11]報道的四川地區(qū)非人靈長類賈第蟲感染率(0.5%)一致。而貴州地區(qū)的感染率(30.0%)遠(yuǎn)高于之前Ye等[14]報道貴州地區(qū)感染率(8.5%)?？傮w而言，本次試驗(yàn)中四川地區(qū)非人靈長類感染率低于貴州地區(qū)非人靈長類賈第蟲感染率(30%)，也低于北京(13.89%)、上海(2.34%)、河北(0.98%)、河南(2.73%)等地的賈第蟲感染率。但四川地區(qū)非人靈長類感染率高于廣東(0.3%)地區(qū)[11]。本試驗(yàn)采集的5個動物園樣品中，貴陽動物園檢測出陽性率為30.0%，成都市高新區(qū)獼猴養(yǎng)殖場檢測出陽性率為1.67%，其他動物園未檢出賈第蟲感染。貴陽動物園的非人靈長類賈第蟲感染率僅低于長沙野生動物園感染率(44.0%)，高于石家莊動物園(11.2%)、武漢動物園(7.6%)、太原動物園(13.6)、北京動物園(22.2%)、上海動物園(8.2%)、上海野生動物園(20.9%)等[15]。不同動物園出現(xiàn)的感染率差異可能與各地飼養(yǎng)密度、管理差異以及賈第蟲的單宿主生活史等相關(guān)[16]。

▲，本實(shí)驗(yàn)所得序列▲ Represents the sequence obtained from this experiment圖1 非人靈長類賈第蟲bg基因位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on bg gene sequence of G. duodenalis in non-human primates

▲，本實(shí)驗(yàn)所得序列▲ Represents the sequence obtained from this experiment圖2 非人靈長類賈第蟲tpi基因位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on tpi gene sequence of Giardia duodenalis in non-human primates

賈第蟲(G.duodenalis)是一種可感染人、家畜和多種野生動物的人獸共患寄生蟲。非人靈長類中已發(fā)現(xiàn)賈第蟲集聚體A、B和E，其中集聚體B是感染非人靈長類的主要集聚體[1，13，17]，也是感染人的主要集聚體之一[6]。此次調(diào)查采用β-giardin、tpi和gdh等多位點(diǎn)基因序列分析顯示，西南部分地區(qū)賈第蟲陽性樣品均為集聚體B，與先前報道的結(jié)論一致。序列分析結(jié)果顯示gdh基因位點(diǎn)較保守，所有樣本均鑒定為BIV亞型，Karim等也曾于國內(nèi)非人靈長類中檢測出此亞型[15]。而bg基因位點(diǎn)和tpi基因位點(diǎn)的差異性較大，分別鑒定出5和6個亞型。其中bg位點(diǎn)中的BIII亞型和tpi位點(diǎn)中的EB5，BIV和B7均為人獸共患亞型。

本研究首次采用多位點(diǎn)基因序列分析法對西南部分地區(qū)圈養(yǎng)非人靈長類賈第蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查，同時對感染蟲種亞型進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，西南部分地區(qū)非人靈長類賈第蟲bg基因和tpi基因多樣性高，亞型種類豐富，基于各位點(diǎn)鑒定出的亞型與國內(nèi)其他地區(qū)已鑒定出的非人靈長類亞型存在一定差異，表明賈第蟲集聚體亞型分布存在地理差異，可能由于傳染源不同所致[1]。本實(shí)驗(yàn)鑒定的亞型中BIII、BIV、EB5都曾在人類中被發(fā)現(xiàn)，提示西南部分地區(qū)非人靈長類感染的賈第蟲存在人獸共患風(fēng)險，但人獸共患集聚體B在非人靈長類源賈第蟲中是否為優(yōu)勢集聚體還需進(jìn)一步研究。由于本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了非人靈長類中存在人獸共患賈第蟲亞型，因此在對圈養(yǎng)非人靈長類的飼養(yǎng)、保護(hù)和研究中，飼養(yǎng)員、研究人員和游客因能近距離直接或間接接觸到圈養(yǎng)非人靈長類動物，因此對相關(guān)的人員存在潛在的威脅。此外，圈養(yǎng)非人靈長類動物可能通過糞便排泄有感染性的包囊而污染周圍環(huán)境，所以在圈養(yǎng)環(huán)境下需要特別注意飲用水、生活用水以及食品安全等[4-5]。除此之外有必要對圈養(yǎng)非人靈長類動物進(jìn)行定期、長期的賈第蟲等人獸共患寄生蟲感染的監(jiān)測工作及驅(qū)蟲工作。

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