利用GSS高通量測序技術(shù)分析不同生境下霍山石斛內(nèi)生真菌群落的分布

張培良，王國凱，梁益敏，馬宗慧，劉海濤，韓 婧，吳 娟，王 剛

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

植物內(nèi)生真菌是指在植物的部分或全部生長史中，生活在健康植物組織和細(xì)胞間，但又不引起任何病癥的真菌[1]。近年來，對內(nèi)生真菌的研究提示，內(nèi)生真菌具有促進(jìn)宿主植物的生長以及增加宿主抵抗逆境的能力，甚至還能促進(jìn)宿主活性成分的合成和積累[2-4]，這些內(nèi)生真菌特殊的生物學(xué)特性表明內(nèi)生真菌在藥材的生長以及道地性形成中具有至關(guān)重要的作用[5]。此外，內(nèi)生真菌還表現(xiàn)出生長區(qū)域?qū)傩?，即不同產(chǎn)地的同一種藥材其內(nèi)生真菌群落分布具有差異性[6]，這使得內(nèi)生真菌成為研究藥材道地性形成的重要因子。

霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)又稱米斛，是安徽省道地藥材。本研究以不同產(chǎn)地以及不同栽培方式下的霍山石斛為樣本，運(yùn)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，在確定各樣本均為霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)同屬種的基礎(chǔ)上，探討在不同生境下霍山石斛內(nèi)生真菌群落分布的特征性，以期能夠從內(nèi)生真菌角度，為建立新的藥材道地性鑒別模式奠定科學(xué)基礎(chǔ)。綠盾測序(Green Shield Sequencing，GSS)是由Illumina高通量測序技術(shù)改進(jìn)的最新測序技術(shù)，其不僅具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低運(yùn)行成本的特點(diǎn)，還可以從源頭上消除宿主植物樣本中葉綠體和線粒體序列帶來的干擾，還原樣本中微生物群體的真實(shí)比例。這為更全面地探討霍山石斛內(nèi)生真菌的分布提供了技術(shù)保障。

1 材料

霍山石斛樣品來源：六安霍山(盆栽)，六安霍山(地栽)，六安霍山(樹栽)，安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥園(盆栽)和宣城涇縣(盆栽)，共5種來源，每種來源平行采集3份樣品。LP0、LP1、LP2：六安霍山(盆栽)；LD0、LD1、LD2：六安霍山(地栽)；LS0、LS1、LS2：六安霍山(樹栽)；HP0、HP1、HP2：安徽中醫(yī)藥大學(xué)少荃湖校區(qū)藥園(合肥，盆栽)；JP0、JP1、JP2：宣城涇縣(盆栽)。以上樣品均采集于2017年8月。

2 霍山石斛樣品種質(zhì)鑒定

2.1 樣品處理 將每種來源采集的霍山石斛樣品各取一份，編號(hào)分別為LP0、LD0、LS0、HP0、JP0，送至中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，采用DNA分子標(biāo)定技術(shù)并以中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)——霍山石斛的特異性PCR鑒別法為執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定。每份樣品取0.1 g，置球磨粉碎儀中充分研磨粉碎加適量液氮研磨至能過五號(hào)篩。

2.2 DNA提取 取待測霍山石斛樣品粉末0.05 g于2.0 mL微量離心管中，加入1 000 μL已滅菌的前處理緩沖液、0.02 g PVP 40、10 μL β-巰基乙醇充分振蕩混勻，65 ℃水浴1 h，期間輕搖2～3次；結(jié)束后取出冷卻至室溫(25 ℃)，12 000 ×g離心10 min，棄上清；加入1 000 μL已滅菌的CTAB提取緩沖液、0.02 g PVP 40、10 μL β-巰基乙醇充分振蕩混勻，65 ℃水浴30 min，結(jié)束后取出冷卻至室溫(25 ℃)；加入900 μL氯仿-異戊醇(容積比24∶1)，充分振蕩混勻，12 000 ×g離心10 min；轉(zhuǎn)移750 μL上層清液至另一新的2.0 mL的微量離心管中，加入750 μL氯仿-異戊醇(容積比24∶1)，充分振蕩混勻，12 000×g離心10 min；轉(zhuǎn)移500 μL上層清液至另一新的2.0 mL微量離心管中，加入330 μL異丙醇溶液，置-20 ℃放置1 h；取出，12 000×g離心10 min，棄上層清液，加入70%乙醇 500 μL漂洗1 min，12 000×g離心5 min，棄上清；再加入70%乙醇 500 μL漂洗1 min，12 000×g離心5 min，棄上清；加入無水乙醇500 μL漂洗1 min，12 000×g離心5 min，棄盡上清；將具有DNA沉淀的微量離心管水平放置于37 ℃孵箱30 min揮干乙醇，加入50 μL滅菌水溶解沉淀，-20 ℃保存。

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 霍山石斛特異性鑒別引物：HSSH-210正向引物序列: 5′-TTGATTGGATTGAGCCTTG-3′和HSSH-210反向引物序列：5′-GGTTTTTAGCTACTAACGTAACAC-3′。在200 μL的PCR管中依次加入10×PCR緩沖液2.5 μL、dNTP混合液(總濃度為10 mmol/L)1 μL、鑒別引物溶液(含正向和反向引物)各0.25 μL、Taq DNA聚合酶1 U、模板DNA 1 μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)容積至25 μL。將反應(yīng)液振蕩混勻，瞬時(shí)離心。將PCR管置PCR儀內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 5 min，循環(huán)反應(yīng) 35次 (95 ℃ 20 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s), 72 ℃延伸 7 min，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。取出PCR管，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測或置4 ℃下保存。

2.4 凝膠電泳 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5 μL 6倍上樣緩沖液混勻后，取5 μL于GelRed染色的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性對照為23-17(霍山石斛，太平畈)；陰性對照：TPSH-01(鐵皮石斛，安徽涇縣)；空白對照(雙蒸水)。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上以DL 2 000 DNA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)(應(yīng)含有100、250、500、750、1 000 bp條帶)觀察、成像。

3 霍山石斛內(nèi)生真菌的檢測

3.1 樣品處理 將余下的10份霍山石斛樣品(LP1、LP2、LD1、LD2、LS1、LS2、HP1、HP2、JP1、JP2)洗凈，并對其表面進(jìn)行無菌操作：75%乙醇漂洗1～2 min，3.5%次氯酸鈉漂洗3 min，75%乙醇漂洗30 s，最后用無菌水沖洗4～6次，再用無菌濾紙吸干表面水分，分別裝入無菌樣品袋中，低溫保存。

3.2 DNA提取 使用環(huán)境樣本DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA抽提后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

3.3 PCR擴(kuò)增 按指定測序區(qū)域，合成帶有Barcode的特異引物ITS3 (5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′) 和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對樣本的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，每個(gè)PCR反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期，PCR結(jié)束后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量并均一化，構(gòu)建ITS測序文庫，利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，測序試劑盒使用Illumina公司MiSeq Reagent Kit v2。

3.4 數(shù)據(jù)分析

3.4.1 生物信息學(xué)分析 Miseq測序得到的PE reads首先使用FLASH3進(jìn)行拼接，同時(shí)對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列等操作過程后完成數(shù)據(jù)過濾，得到可供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列。在97%的相似性水平上使用UPARSE算法進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚類，統(tǒng)計(jì)樣品每個(gè)OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。

3.4.2 分類學(xué)分析 采用uclust分類法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，得到每個(gè)OTU對應(yīng)的物種分類信息。

3.4.3 群落組成分析 根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知一個(gè)或多個(gè)樣本在各分類水平上的分類學(xué)比較情況。在結(jié)果中，包含了兩類信息：①樣本中含有何種微生物；②樣本中各微生物的序列數(shù)，即各微生物的相對豐度。

因此，可以使用多種數(shù)據(jù)展示方法觀測樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)或組成差別。將多個(gè)樣本放在一起比較時(shí)，還可以觀測群落組成在一定條件下的變化情況。

3.4.4 Alpha多樣性分析 通過樣本的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐度、均勻性及多樣性等，這其中包括一系列生態(tài)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)，如Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、香農(nóng)-維納指數(shù)(Shannon-Wiener index)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(Phylogenetic diversity，PD)等，以上豐度指數(shù)計(jì)算用Mothur 1.30.1軟件完成。

3.4.5 Venn圖 在OTU分析中，Venn圖用于表示多個(gè)組樣品的OTU共有和獨(dú)有的情況。

3.4.6 熱度圖(Heatmap) Heatmap用于表示一個(gè)或多個(gè)組的樣品在某一分類水平上的群落組成和豐度。豐度用顏色深淺來表征，顏色越偏紅表明該種的豐度越高，越偏藍(lán)表明豐度越低。

4 結(jié)果

4.1 霍山石斛樣品種質(zhì)鑒定 使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法進(jìn)行鑒別，樣品LS0、LD0、JP0、LP0和HP0的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)束后，其凝膠電泳圖譜中，與陽性對照凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置(250～500 bp)有單一的DNA條帶，陰性對照和空白對照相應(yīng)位置上無條帶(見圖1)。結(jié)果說明本研究所采集的石斛樣品與生物學(xué)意義上的霍山石斛具有一致性，為正品霍山石斛。

注：M. DL 2000 plus DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P.霍山石斛陽性對照；1. 樣品LS0；2. LD0；3. JP0；4. LP0；5. HP0；N. 陰性對照(鐵皮石斛)；B. 空白對照

圖1霍山石斛樣品16 S rDNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

4.2 霍山石斛樣品內(nèi)生真菌群落組成分析 圖2從屬水平(Genus)展示了不同生境以及同一生境下霍山石斛內(nèi)生真菌的群落組成。六安霍山(盆栽)的霍山石斛樣本其內(nèi)生真菌主要分布于Xenopolyscytalum、Botryotinia、Alternaria、Zasmidum、Cystofilobasidium、Oidiodendron、Chalara、Pestalotiopsis等中；六安霍山(地栽)的霍山石斛樣本其內(nèi)生真菌主要分布于Glomerella、Alternaria、Zasmidum、Pestalotiopsis等中；六安霍山(樹栽)的霍山石斛樣本其內(nèi)生真菌主要分布于Xenopolyscytalum、Bot-ryotinia、Alternaria、Cystofilobasidium、Oidiodendron、Chalara、Pestalotiopsis等中；安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥園(盆栽)的霍山石斛樣本其內(nèi)生真菌主要分布于Glomerella、Alternaria、Zasmidum、Rosellinia、Pestalotiopsis等中；宣城涇縣(盆栽)的霍山石斛樣本其內(nèi)生真菌主要分布于Glomerella、Alternaria、Zasmidum、Cystofilobasidium等中。這表明處于不同生境下的霍山石斛其內(nèi)生真菌群落組成具有一定的差異性。另外，同一來源(即同一生境)下平行的兩個(gè)霍山石斛樣本其內(nèi)生真菌的相對豐度相差較大，但群落組成基本相同。

圖2 樣品內(nèi)生真菌群落分布圖

4.3 不同生境下霍山石斛內(nèi)生真菌的Alpha多樣性分析 由圖3可知，在內(nèi)生真菌豐度方面(Chao 1表示)，來源于六安霍山(樹栽)的霍山石斛的內(nèi)生真菌豐度最高；在多樣性方面(Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)表示)，來源于六安霍山(盆栽)的霍山石斛的內(nèi)生真菌多樣性最高。這表明隨著生長環(huán)境的改變，霍山石斛內(nèi)生真菌的豐度以及多樣性隨之產(chǎn)生了變化。圖中同一來源的兩個(gè)平行霍山石斛樣本之間內(nèi)生真菌的Chao 1、Shannon和Simpson等分析指標(biāo)并不處于同一水平上，表明同一來源的兩個(gè)霍山石斛內(nèi)生真菌的豐度以及多樣性亦具有一定的差異性。

4.4 同一來源兩個(gè)平行霍山石斛樣本間的Venn圖 由圖4，通過分析每個(gè)OTU對應(yīng)的物種分類信息，將這些OTU歸屬至種類水平上后，發(fā)現(xiàn)雖然樣本LD1總OTU數(shù)405個(gè)中特有的OTU占186個(gè)，但特有的在物種水平上僅占總物種數(shù)的2.62%。同樣，樣本LD2中總OTU有376個(gè)，特有的OTU有157個(gè)，但僅占總物種數(shù)的1.8%。而兩個(gè)樣本共有的OTU有219個(gè)，卻占了總物種數(shù)的95.58%。

圖3 樣品的Alpha多樣性分析

圖4 六安霍山(地栽)兩個(gè)霍山石斛樣本間的Venn圖

同時(shí)，對LP1(OTU 540個(gè))/LP2(OTU 390個(gè))、LS1(OTU 621個(gè))/LS2(OTU 601個(gè))、HP1(OTU 423個(gè))/HP2(OTU 462個(gè))和JP1(OTU 392個(gè))/JP2(OTU 394個(gè))4組共有的OTU進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在樣本LP1/LP2組中，兩個(gè)樣本共有的OTU有189個(gè)，占總物種數(shù)的84.22%；在LS1/LS2組中，兩個(gè)樣本共有的OTU有246個(gè)，占總物種數(shù)的94.52%；在樣本HP1/HP2組中，兩個(gè)樣本共有的OTU有214個(gè)，占總物種數(shù)的93.59%；在樣本JP1/JP2組中，兩個(gè)樣本共有的OTU有213個(gè)，占總物種數(shù)的94.05%。

以上OTU分析結(jié)果表明，同一來源的兩個(gè)霍山石斛樣本間的內(nèi)生真菌種類具有一定的差異性，這驗(yàn)證了Alpha多樣性分析的結(jié)果。但通過分析每個(gè)OTU對應(yīng)的物種分類信息，并將這些OTU歸屬至種類水平上后，發(fā)現(xiàn)同一生境下霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)的內(nèi)生真菌OTU數(shù)以及物種數(shù)量雖然存在著較大差異，在物種水平上卻顯示其內(nèi)生真菌分布無明顯的差異性，表明同一生境下的霍山石斛內(nèi)生真菌群落組成基本相同，這也驗(yàn)證了由圖2所得的結(jié)果：同一來源(即同一生境)下平行的兩個(gè)霍山石斛樣本其內(nèi)生真菌的相對豐度相差較大，但群落組成基本相同。

4.5 熱度圖 由圖5可知，在種水平上，兩個(gè)六安霍山(盆栽)的霍山石斛中豐度最高的為二孢炱科(Pleosporales)的一個(gè)未知種Pleosporalessp.，兩個(gè)六安霍山(地栽)的霍山石斛中豐度最高的為小叢殼屬(Glomerella)的一株內(nèi)生真菌Glomerellacingulata，兩個(gè)六安霍山(樹栽)的霍山石斛中豐度最高的為二孢炱科(Pleosporales)的一個(gè)未知種Pleosporalessp.，兩個(gè)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥園(盆栽)霍山石斛中豐度最高的為小叢殼屬(Glomerella)的一株內(nèi)生真菌Glomerellacingulata，兩個(gè)宣城涇縣(盆栽)霍山石斛中豐度最高的為座囊菌(Dothideomycetes)的一個(gè)未知種Dothideomycetessp.。這表明不同生境下霍山石斛的優(yōu)勢內(nèi)生真菌會(huì)隨生長環(huán)境以及地域的改變而產(chǎn)生變化，且同一生境下兩個(gè)獨(dú)立的霍山石斛其優(yōu)勢內(nèi)生真菌相同。同時(shí)，同種栽培方式3個(gè)不同產(chǎn)地下的霍山石斛其優(yōu)勢內(nèi)生真菌不同，表現(xiàn)出一定的地域?qū)傩浴?/p>

5 討論

以往在研究藥材內(nèi)生真菌的過程中，多有討論不同產(chǎn)地或不同生境下藥材內(nèi)生真菌的差異性[7-8]，卻鮮有對同一產(chǎn)地或生境下的藥材內(nèi)生真菌的菌落分布情況進(jìn)行探討。本研究利用GSS高通量測序技術(shù)對不同生境下霍山石斛的內(nèi)生真菌差異性進(jìn)行探索，同時(shí)又對同一生境下采集的兩個(gè)平行的霍山石斛樣本的內(nèi)生真菌組成進(jìn)行研究，旨在探討同一生境下兩個(gè)獨(dú)立的霍山石斛的內(nèi)生真菌菌落是否具有相同性，以期為“從內(nèi)生真菌角度建立起霍山石斛道地性鑒別新模式”這一假設(shè)奠定科學(xué)的基礎(chǔ)。所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然同一生境下的兩個(gè)獨(dú)立的霍山石斛樣本的OTU數(shù)以及物種數(shù)量存在著較大差異，但在物種水平上顯示其內(nèi)生真菌群落組成基本相同。

另外，根據(jù)同種栽培方式下3個(gè)產(chǎn)地的霍山石斛優(yōu)勢內(nèi)生真菌表現(xiàn)出一定的地域?qū)傩圆⒔Y(jié)合同一生境下兩個(gè)霍山石斛樣本的優(yōu)勢內(nèi)生真菌相同這一結(jié)果，表明“從內(nèi)生真菌角度建立起霍山石斛道地性鑒別的新模式”這一假設(shè)具有一定的科學(xué)性，同時(shí)也為后期能夠從內(nèi)生真菌角度建立起藥材道地性鑒別的新模式奠定科學(xué)的基礎(chǔ)。

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