Toll樣受體3在大鼠急性心肌梗死中的作用機制

王媛媛 曹建 鄧莉

[摘要] 目的 研究Toll樣受體3（TLR3）在大鼠心肌梗死中的表達及作用機制。 方法 制備TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠，采用球囊結(jié)扎冠脈方法制作心肌梗死動物模型。隨機分為野生型假手術(shù)組（n=15）、野生型心肌梗死組（n=15）、（TLR3-/-）假手術(shù)組（n=15）、（TLR3-/-）心肌梗死組（n=15）。檢測心肌組織肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白cTnI含量；通過Western blot法檢測Toll樣受體3、NF-κB表達。 結(jié)果 與野生型心肌梗死組大鼠比較，（TLR3-/-）心肌梗死組反映心肌損傷的CK-MB、cTnI減低；NF-κB表達降低；各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 TLR3基因缺失在急性心肌梗死中具有心臟保護作用，其保護機制與下調(diào)NF-κB表達，減輕心肌梗死炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] TOLL樣受體3；急性心肌梗死；核因子-κB；基因敲除

[中圖分類號] R541；R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）01-0036-03

Mechanism of Toll-like receptor 3 in acute myocardial infarction in rats

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 DENG Li1

1.Department of Cardiology，the Third Hospital of Nanchang， Nanchang 330009，China； 2.Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang， 330006，China

[Abstract] Objective To study the expression of Toll-like receptor 3（TLR3） in myocardial infarction of rats and its mechanism. Methods TLR3 gene knockout rats and wild-type rats were prepared. Animal models of myocardial infarction were created by balloon ligation of coronary arteries. The rats were randomly divided into wild-type sham surgery group （n=15）， wild-type myocardial infarction group（n=15），（TLR3-/-）sham surgery group（n=15）， and（TLR3-/-）myocardial infarction group（n=15）. The creatine kinase（CK-MB）and troponin cTnI contents in myocardial tissues were measured. Toll-like receptor 3 and NF-κB expressions were detected by Western blot method. Results Compared with the rats in the wild-type myocardial infarction group， the levels of CK-MB and cTnI which reflected myocardial injury in the（TLR3-/-） myocardial infarction group were decreased； NF-κB expression was decreased； the differences between groups were statistically significant（P<0.05）. Conclusion TLR3 gene deletion has cardioprotective effects in acute myocardial infarction. Its protective mechanism is related to the down-regulation of NF-κB expression and alleviation of inflammatory response induced by myocardial infarction.

[Key words] TOLL-like receptor 3； Acute myocardial infarction； NF-κB； Gene knockout

急性心肌梗死是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，研究表明，在心肌梗死后，心肌組織會分泌大量炎性因子（如白細胞介素），炎癥因子局部異常表達及不適當堆積可激活細胞毒性 T 細胞造成心肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙，與心室重塑密切相關(guān)[1-3]。此外還可引起心肌細胞凋亡，在調(diào)節(jié)心臟結(jié)構(gòu)和功能中起到重要作用。調(diào)節(jié)炎性細胞因子網(wǎng)絡(luò)是心肌梗死后重要治療方法之一。

Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）是生物體重要的病原體模式識別信號分子，不同的TLRs識別不同的病毒、細菌、真菌或原生物。TLRs通過促使炎性因子和干擾素釋放來抵抗病原微生物感染其介導的炎癥反應(yīng)，目前TLR3在急性心肌梗死中的作用機制尚未闡明，本實驗通過制備TLR3基因敲除大鼠，并制備急性心肌梗死模型，來觀察TLR3基因敲除后對急性心肌梗死大鼠的心肌保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑材料

本研究已經(jīng)通過南昌大學醫(yī)學院動物倫理委員會審查，許可證號為SCXM（贛）2014-0012，TLR3基因敲除大鼠，8周齡，雌雄各半（由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供）。野生型SD大鼠（南昌大學實驗動物中心提供）。兔抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Sigma公司）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白cTnI檢測試劑盒（武漢亞法生物制品有限公司）、小鼠抗Akt單克隆抗體、TLR3抗體、NF-κB抗體購自美國Santa Cruz公司，蛋白濃度測定標準品購自普利萊公司。

1.2 建立動物模型

實驗動物分為四組，制作大鼠急性心肌梗死模型，雄性SD大鼠，術(shù)前4 h禁食水，SD大鼠稱重后以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，連接小動物呼吸機，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間距主動脈根部2～3 mm處，結(jié)扎左前降支深部，心電圖可見相應(yīng)導聯(lián)sT段抬高，同時肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域心肌變白，局部心肌運動減弱提示結(jié)扎成功。假手術(shù)組僅分離左前降支，不結(jié)扎[4]。野生型假手術(shù)組（n=15），絲線穿過冠狀動脈但不結(jié)扎，通過尾靜脈注射生理鹽水；野生型急性心肌梗死（AMI）對照組（n=15）制作大鼠急性心肌梗死模型；（TLR3-/-）假手術(shù)組（n=15），絲線穿過冠狀動脈左室支但不結(jié)扎，通過尾靜脈注射生理鹽水；（TLR3-/-）急性心肌梗死對照組（n=15）制作大鼠急性心肌梗死模型。

檢測生化指標急性心肌梗死模型制作2 h后，從腹主動脈采血5 mL，靜置30 min，按照試劑盒說明操作，離心10 min（4℃，3000 r/min），進行血清分離，測定血清CK-MB及cTnI的含量，cTnI檢測采用化學發(fā)光免疫分析法，CK-MB檢測采用酶聯(lián)免疫發(fā)光法。

1.3 Western blot法檢測TLR3、NF-κB蛋白表達

制模結(jié)束后處死手術(shù)處理后的存活大鼠，提取按試劑盒說明書步驟提取總蛋白，碾磨心肌組織，BCA法蛋白進行蛋白定量，SDS-PAGE分離樣品后轉(zhuǎn)膜，常溫下TBST封閉過夜，加入一抗后室溫下免疫沉淀1 h，再加入兔抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗2 h，顯影，定影，掃描。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件處理。計量資料采用均值±標準差（x±s）表示，采用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1各組cTnI、CK-MB水平比較

與野生型急性心肌梗死組比較，（TLR3-/-）組反映心肌缺血損傷的cTnI、CK-MB含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、2。

2.2各組心肌組織TLR3、NF-κB蛋白表達

通過Western blot 法檢測各組TLR3、NF-κB蛋白水平。與野生型假手術(shù)組比較，野生型AMI組TLR3、NF-κB蛋白表達均增高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義；與野生型AMI組比較，（TLR3-/-）AMI組TLR3蛋白、NF-κB蛋白表達均降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2、3。

3 討論

急性心肌梗死致死致殘率高，是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，缺血心肌細胞線粒體功能障礙導致需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇，誘導細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，線粒體內(nèi)膜通透性改變，介導的心肌細胞凋亡、從而存活心肌細胞減少，從而導致急性心肌梗死患者梗死后心衰[5-9]。

Toll樣受體是內(nèi)源性免疫的一個重要分子家族，分為細胞外區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)，內(nèi)區(qū)與白細胞介素-1受體結(jié)構(gòu)相似的信號傳導結(jié)構(gòu)域組成，能識別侵入體內(nèi)異物，不僅激活固有免疫應(yīng)答，還可以激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，啟動下游的信號通路，通過募集中性粒細胞、吞噬細胞誘導炎癥反應(yīng)，釋放大量的炎癥因子（如各種白介素因子）介導炎癥的產(chǎn)生，不同的病原體入侵可激活相應(yīng)的TLR，從而誘發(fā)初始免疫反應(yīng)產(chǎn)生炎癥。TLR3由904個氨基酸組成，其相對分子量約為125 ku，研究發(fā)現(xiàn)TLR3可誘導血管活性氧產(chǎn)生增加，可引起血管舒張功能受損、再內(nèi)皮化減少加劇內(nèi)皮細胞功能受損[10-14]。同時TLR3還可以識別病毒、細菌和受感染細胞中的核酸成分，誘導產(chǎn)生促炎癥細胞因子，人類TLR3在人動脈粥樣硬化組織起源的平滑肌細胞上的表達上調(diào)，可引起許多趨化因子和炎性細胞因子表達增加[15-17]。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB作為可誘導并普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，可對相當多數(shù)量的基因發(fā)揮中心性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，在免疫、炎癥、細胞的生存、增殖分化和凋亡等方面起到廣泛而重要作用。通過對腫瘤壞死因子、細胞介素（IL-1，IL-，6，IL-8）等基因的誘導性調(diào)節(jié)作用，誘導增加炎癥反應(yīng)[18-21]。

本實驗通過TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠制作急性心肌梗死模型。野生型實驗組經(jīng)過急性心肌梗死處理，與假手術(shù)組比較，cTnI、CK-MB含量增加，TLR3蛋白及NF-κB表達增加。與野生型急性心肌梗死組比較，（TLR3-/- ）急性心肌梗死組cTnI、CK-MB含量減少。TLR3蛋白減低，NF-κB表達降低。本實驗結(jié)果提示急性心肌梗死可以刺激TLR3表達，進一步激活NF-κB，引起心肌炎癥反應(yīng)，引起心肌損傷；而在TLR3基因敲除組大鼠，TLR3蛋白表達下降，急性心肌缺血損傷后，NF-κB表達下降，cTnI、CK-MB較野生型含量減少，提示TLR3基因缺失可通過減少NF-κB表達減輕炎癥反應(yīng)，對急性梗死心肌起到保護作用。提示 TLR3在急性心肌梗死的發(fā)展過程中起著保護作用，但其確切的機制尚未完全明確，需要進一步明確，為治療急性心肌梗死提供新的治療靶點。

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（收稿日期：2017-09-25）