清肺抑火中藥干預(yù)大氣PM_2.5對(duì)大鼠肺部炎癥損傷的實(shí)驗(yàn)研究

楊瑩瑩　劉潔　蔣蓉芳等

摘要：目的 探討中藥清肺抑火中藥對(duì)PM2，致大鼠肺部炎癥損傷的干預(yù)作用。方法 將42只健康成年Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為7組，分別為空白對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組、干預(yù)對(duì)照組、染毒對(duì)照組、低劑量干預(yù)組、中劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組。處理結(jié)束后，收集各組大鼠肺泡灌洗液（BALF），并測定BALF中生化指標(biāo)和炎癥因子水平的變化。結(jié)果 與生理鹽水對(duì)照組比較，染毒對(duì)照組BALF中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）的活力和總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、超敏C反應(yīng)蛋白（HS-CRP）含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低、中、高劑量干預(yù)組BALF中生化指標(biāo)和炎癥因子水平比染毒對(duì)照組水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 清肺抑火中藥可能通過抗細(xì)胞毒性和抗炎癥作用，減輕PM_2.5暴露對(duì)大鼠肺部產(chǎn)生的損傷。

關(guān)鍵詞：PM_2.5；中藥；干預(yù) 中圖分類號(hào)：R114 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道大氣顆粒物污染造成全球1%的心肺系統(tǒng)疾病和3%的氣管、支氣管疾病及肺癌，每年導(dǎo)致約60萬居民早死和740萬失能調(diào)整生命年（disabilily adjusted of lire years，DALY）的損失。由于PM_2.5粒徑小，表面積大，吸附有更多微小的有害物質(zhì)，可通過呼吸到達(dá)肺泡并沉積在肺泡，甚至可以通過氣血屏障隨血液到達(dá)其他器官，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的損傷。研究表明，PM_2.5暴露與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生有明顯的相關(guān)性，如肺功能降低、哮喘發(fā)作、支氣管炎癥以及肺癌等。目前認(rèn)為炎癥損傷和氧化應(yīng)激損傷是PM_2.5對(duì)呼吸系統(tǒng)致病的主要機(jī)制，主要表現(xiàn)為PM_2.5進(jìn)入機(jī)體后，通過多種途徑刺激炎性細(xì)胞釋放大量炎癥因子，誘發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng)，過多的炎癥因子本身所具有的機(jī)體破壞性對(duì)肺部正常組織或細(xì)胞造成損傷，引起肺部組織增生和纖維化，最終導(dǎo)致機(jī)體、肺部疾病的發(fā)生。為減小PM_2.5暴露對(duì)機(jī)體的損傷，研究者一直試圖尋找安全、有效拮抗PM_2.5對(duì)機(jī)體損傷的物質(zhì)，如口罩、空氣凈化器、保健品（維生素C、維生素E、深海魚油等）。已有不少天然物質(zhì)引入干預(yù)PM_2.5對(duì)機(jī)體損傷的研究，如具有抗炎、抗氧化作用的黑巧克力、番茄紅素、人參皂苷Rgl等。清肺抑火方劑來源于中醫(yī)古方《壽世保元》，是一種由抗炎和抗氧化的天然藥物制成的復(fù)方中藥制劑，包含黃芩、梔子、天花粉、知母、大黃、黃柏、前胡、苦參和桔梗九味中藥，具有清肺止咳、降火生津的功效。本研究以氣管滴注PM_2.5混懸液染毒大鼠造成的肺部炎癥損傷為模型，在PM_2.5染毒后給予清肺抑火中藥干預(yù)，觀察大鼠肺泡灌洗液中生化指標(biāo)和炎癥指標(biāo)的水平變化，探討清肺抑火中藥對(duì)PM_2.5染毒所致大鼠肺部炎癥損傷的干預(yù)作用。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Thermo Anderson G-2.5大流量采樣器為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，紫外可見分光光度計(jì)為上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，MK3酶聯(lián)免疫檢測儀為廣州DENLEY公司產(chǎn)品，LGJ-10D冷凍真空干燥機(jī)為北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，JL-180H超聲波清洗機(jī)購自南京科捷分析儀器有限公司，玻璃纖維濾膜購自河北省故城縣環(huán)境檢測器材廠。酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）標(biāo)準(zhǔn)比色試劑盒購自南京建成生物工程研究所。超敏C反應(yīng)蛋白（HS-CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒購自美國EBIOSCIENCE公司。中性福爾馬林固定液、二甲苯、石蠟、蘇木精染液、1%伊紅酒精溶液、1%鹽酸酒精溶液、95%乙醇、無水乙醇、中性樹膠購自國藥集團(tuán)。

1.2PM_2.5采集與處理

于上海市某居住區(qū)[附近無工業(yè)企業(yè)，周圍人口較密集，采樣期間監(jiān)測PM_2.5濃度值為（39.95±22.33）μg/m³]，用大流量采樣器（采樣高度為16 m）采集大氣PM_2.5于玻璃纖維濾膜（孔徑2.5μm）上。將載有PM_2.5的玻璃纖維濾膜去掉邊緣部分，裁剪為1 cm×3 cm大小，放入錐形瓶，浸入超純水中，低溫超聲震蕩30 min×3次，將PM_2.5洗脫。6層紗布置于漏斗上，用于過濾PM_2.5震蕩液，濾液真空冷凍干燥，收集PM_2.5顆粒放于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用前，取一定量的PM_2.5顆粒物和0.9%生理鹽水制成濃度為8.89 mg/mL的PM_2.5混懸液（本研究中PM_2.5染毒劑量為40 mg/kg體重，每次給予PM_2.5生理鹽水混懸液的體積為4.5mL/kg，則所需配制的PM_2.5混懸液濃度為40mg/kg÷4.5 mL/kg=8.89 mg/mL，以體重計(jì)），超聲震蕩10 min混勻滅菌，4℃保存。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠42只，體重180～200 g，購于上海西普爾一畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2008001641248。復(fù)旦大學(xué)倫理委員批準(zhǔn)本實(shí)驗(yàn)，批準(zhǔn)號(hào)：20150652C002。動(dòng)物購入后，在動(dòng)物飼養(yǎng)室分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只，飼養(yǎng)室溫度18～22℃，相對(duì)濕度45%～55%，12 h晝夜交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為7組，每組6只。清肺抑火膠囊去外殼，將內(nèi)容物黃芩等九味中藥制成的粉末用濃度為0.2%的羧甲基纖維素溶液制成低、中、高濃度的混懸液。各組動(dòng)物處理如下：空白對(duì)照組每天灌胃給予相應(yīng)劑量以體重計(jì)（下同）為10 ml/kg 0.2%羧甲基纖維素溶液，持續(xù)1周；生理鹽水對(duì)照組氣管滴注1.5 mL/kg的生理鹽水，隔天1次，共1周；干預(yù)對(duì)照組每天灌胃給與0.66 g/kg的清肺抑火中藥混懸液1次，給藥1周；染毒對(duì)照組氣管滴注40 mg/kg的PM_2.5生理鹽水混懸液染毒，隔天1次，共3次；低、中、高劑量干預(yù)組在實(shí)驗(yàn)第1周氣管滴注40 mg/kg的PM_2.5生理鹽水混懸液染毒，隔天1次，共3次，實(shí)驗(yàn)第2周開始每天灌胃依次給予0.07/kg、0.33/kg和0.66g/kg清肺抑火中藥混懸液1次，共7次。

1.4大鼠一般體征觀察

研究開始時(shí)、第1周結(jié)束時(shí)和第2周結(jié)束時(shí)均測量并記錄每只大鼠體重，并在研究期間觀察各大鼠總體活動(dòng)情況及呼吸狀況等指標(biāo)。

1.5肺泡灌洗液提取與分析

于所有處理結(jié)束后24 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，劑量為3 mL/kg。稱重后，腹主動(dòng)脈取血。用手術(shù)剪刀打開胸腔，止血鉗夾住一側(cè)肺葉，另一側(cè)用37℃預(yù)溫的生理鹽水灌洗3～4次，收集支氣管肺泡灌洗液（broehoalveolar lavage fluid，BALF）。將提取的BALF經(jīng)4℃、3000 r/min（1006×g）冷凍離心20 min。離心后的沉淀細(xì)胞懸液制作涂片，用瑞士一吉姆薩復(fù)合染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。取離心上清液，分裝放在凍存管中，于-80%冰箱保存。采用相應(yīng)的試劑盒測定大鼠BALF中的酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）的活力和總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）；用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和超敏C反應(yīng)蛋白（HS-CRP）水平，測定過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示。兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較用studentstest進(jìn)行檢驗(yàn)；多組獨(dú)立樣本均數(shù)比較用單因素方差分析（One-Way ANO-VA），應(yīng)用最小顯著差法（Least significant differ-ence，LSD）進(jìn)行組間兩兩比較，應(yīng)用Levene法檢驗(yàn)獨(dú)立樣本間的方差齊性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2結(jié)果

2.1大鼠一般體征變化

實(shí)驗(yàn)期間未見大鼠死亡?？瞻讓?duì)照組、生理鹽水對(duì)照組和干預(yù)對(duì)照組大鼠活動(dòng)未見異常。染毒對(duì)照組大鼠PM_2.5染毒后出現(xiàn)呼吸急促、腹式呼吸幅度增加的癥狀，細(xì)聽可聞及哮鳴音，總體活動(dòng)量減少。低、中、高劑量干預(yù)組大鼠用清肺抑火中藥干預(yù)后，呼吸急促有緩解，哮鳴音和腹式呼吸減少。干預(yù)對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組與空白對(duì)照組大鼠的體重正常增長，且實(shí)驗(yàn)開始第1周（動(dòng)物飼養(yǎng)第3天）、第2周（動(dòng)物飼養(yǎng)第17天）結(jié)束時(shí)，3組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。染毒對(duì)照組和低、中、高劑量干預(yù)組在第1周染毒、第2周干預(yù)結(jié)束時(shí)的體重均顯著低于生理鹽水對(duì)照組（P<0.05）。見表1。

2.2 BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和肺體比

與空白對(duì)照組比較，干預(yù)對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組大鼠BALF中的中性粒細(xì)胞百分比、肺體比均無顯著性差異。與生理鹽水對(duì)照組相比，染毒對(duì)照組大鼠BALF中的中性粒細(xì)胞百分比、肺體比均顯著升高（P<0.05）。與染毒對(duì)照組相比，低、中、高劑量干預(yù)組的中性粒細(xì)胞百分比均呈藥物劑量依賴性降低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組大鼠肺泡灌洗液中的淋巴細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組比較，干預(yù)對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組大鼠肺體比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與生理鹽水對(duì)照組比較，染毒對(duì)照組和低、中、高劑量干預(yù)組肺體比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低劑量干預(yù)組較染毒對(duì)照組的肺體比顯著性降低（P<0.05）。見表2。

2.3 BALF中各生化指標(biāo)測定

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)細(xì)胞毒性指標(biāo)ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量的測定，觀察各組動(dòng)物的肺部細(xì)胞和肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷情況。干預(yù)對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，BALF中的ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與生理鹽水對(duì)照組比較，染毒對(duì)照組大鼠BALF中ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量均顯著升高（P<0.05）。與染毒對(duì)照組比較，低、中、高劑量干預(yù)組大鼠BALF中的生化指標(biāo)含量均呈藥物劑量依賴性降低。見表3。

2.4 BALF中炎癥損傷指標(biāo)測定

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-ot、HS-CRP和IL-1β因子的測試，觀察各組動(dòng)物的機(jī)體炎性損傷情況。干預(yù)對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，BALF中的IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β濃度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與生理鹽水對(duì)照組比較，染毒對(duì)照組大鼠BALF中IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β濃度均顯著升高（P<0.05）。與染毒對(duì)照組比較，低、中、高劑量干預(yù)組大鼠BALF中的IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β水平呈藥物劑量依賴性降低。見表4。

3討論

清肺抑火膠囊中多味中藥具有免疫抑制、抗炎和抗氧化的作用。黃芩的提取物對(duì)羥自由基、烷自由基等具有較強(qiáng)的清除功能，可提高腎組織中GSH、SOD的活性，具有抗腎組織纖維化的作用。梔子提取物可降低LPS誘導(dǎo)的大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、細(xì)胞活性氧含量和NF-KB活性，具有一定的抗炎作用。天花粉可抗炎、抗病毒、降血糖。知母提取物可提高小鼠腦組織中抗氧化酶SOD活性，發(fā)揮抗氧化、抗衰老的作用，還可減少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的合成，阻斷NF-KB的生成，具有抗炎作用。大黃可抑制大鼠體內(nèi)炎癥因子的激活與釋放，具有明顯的抗炎作用。黃柏具有免疫抑制、抗炎和清除氧自由基的抗氧化作用。前胡具有舒張肺動(dòng)脈高壓，改善心臟舒張功能，降低大腦動(dòng)脈梗死大鼠血清中炎性細(xì)胞因子水平和抗腫瘤等功效?？鄥⒌挠行С煞挚鄥A可影響炎癥調(diào)節(jié)因子的水平，具有抗炎作用。桔梗具有祛痰鎮(zhèn)咳、清除氧自由基的抗氧化作用。

動(dòng)物體重增長狀況可客觀地反映動(dòng)物的生長發(fā)育和新陳代謝功能，可以作為PM_2.5暴露對(duì)動(dòng)物健康影響的一項(xiàng)宏觀指標(biāo)。本研究中，PM_2.5染毒導(dǎo)致大鼠體重增長低于正常水平，與用打印機(jī)墨盒內(nèi)顆粒物染毒小鼠的研究結(jié)果相似?？赡茉?yàn)?，PM_2.5染毒引起大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)等多種不適，導(dǎo)致食欲下降，同時(shí)大鼠自身要修復(fù)機(jī)體的損傷，需要消耗更多的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，最終影響大鼠的正常生長發(fā)育。

研究表明，顆粒物隨呼吸進(jìn)入呼吸道和肺部以后，可通過氧化應(yīng)激或炎癥損傷等機(jī)制破壞肺泡腔血管基底膜和毛細(xì)血管膜結(jié)構(gòu)，改變肺泡細(xì)胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，增加細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種蛋白酶等內(nèi)容物漏出。ACP是一種主要存在于巨噬細(xì)胞的溶酶體酶，可參與機(jī)體的防御反應(yīng)，當(dāng)巨噬細(xì)胞吞噬異物裂解死亡后，就會(huì)有大量的ACP從巨噬細(xì)胞釋放到肺泡灌洗液中。AKP主要由肺泡Ⅱ型細(xì)胞產(chǎn)生，其含量多少提示肺泡Ⅱ型細(xì)胞受損程度。LDH是一種廣泛存在于機(jī)體各組織細(xì)胞中的胞漿酶，肺泡腔內(nèi)的LDH主要來源于肺泡細(xì)胞損傷后滲漏和血液滲漏，肺泡腔內(nèi)LDH水平可反映肺組織細(xì)胞膜受損程度，是一種反映細(xì)胞毒性的指標(biāo)。肺部毛細(xì)血管通透性增加后，會(huì)有大量的TP、ALB滲出到肺泡腔，肺泡灌洗液中TP、ALB含量的多少可反映肺泡上皮一毛細(xì)血管通透性情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染毒對(duì)照組中細(xì)胞毒性指標(biāo)（ACP、AKP、LDH活性和TP、ALB含量）均高于生理鹽水對(duì)照組，表明PM_2.5染毒可能會(huì)增加肺泡細(xì)胞膜和肺泡上皮一毛細(xì)血管膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種蛋白酶等內(nèi)容物漏出，對(duì)肺泡細(xì)胞產(chǎn)生毒作用。各劑量干預(yù)組肺泡灌洗液內(nèi)細(xì)胞毒性指標(biāo)水平均呈藥物劑量依賴性降低，提示清肺抑火中藥對(duì)PM_2.5引起的肺組織毒性損傷有一定改善作用。

呼吸道是大氣PM_2.5直接作用的靶器官，大氣PM_2.5暴露會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞數(shù)升高，引起炎癥反應(yīng)。目前研究表明，與顆粒物引起呼吸道炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子包括IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8、INF等。TNF-α是前炎癥因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用、白細(xì)胞的遷移，以利于細(xì)胞向炎癥部位遷移而增強(qiáng)其毒性作用。也有研究認(rèn)為，肺泡灌洗液中TNF-α釋放量增加可能是肺纖維化疾病診斷的早期敏感標(biāo)志。IL-6表達(dá)水平的變化是機(jī)體早期炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)，IL-6主要由單核一巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，具有多種生物活性，可誘導(dǎo)CRP等急性期反應(yīng)蛋白的合成，加強(qiáng)其他細(xì)胞因子（如INF、IL-1）的效果，參與炎癥反應(yīng)。IL-1β是重要的前炎癥因子，可刺激IL-8等多種趨化因子的產(chǎn)生，募集炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大機(jī)體的炎癥反應(yīng)。HS-CRP是一種急性相反應(yīng)中重要的蛋白，可上調(diào)細(xì)胞黏附因子和單核細(xì)胞趨化因子水平，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，參與局部或全身炎癥反應(yīng)。當(dāng)有炎癥存在時(shí)，HS-CRP水平會(huì)急劇升高，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的一個(gè)敏感指標(biāo)。流行病學(xué)研究表明，大氣顆粒物污染會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)CRP水平的升高。本實(shí)驗(yàn)中，染毒對(duì)照組的肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6、IL-1B、TNF-α、HS-CRP含量和中性粒細(xì)胞百分比均高于生理鹽水對(duì)照組，表明PM_2.5染毒可以升高大鼠機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子水平，引發(fā)炎癥反應(yīng)，與夏萍萍等研究結(jié)果一致。各劑量干預(yù)組中，細(xì)胞炎癥因子水平和中性粒細(xì)胞百分比均呈一定程度的藥物劑量依賴性降低，表明清肺抑火中藥對(duì)PM_2.5染毒引起的肺組織炎癥反應(yīng)有一定程度的減輕，也提示清肺抑火中藥可能是通過改變炎性因子的釋放量來干預(yù)PM_2.5導(dǎo)致的肺組織損傷。清肺抑火中藥對(duì)PM_2.5所致的大鼠急性肺部損傷具有一定的緩解作用，其可能的機(jī)制為通過降低PM_2.5對(duì)肺部的細(xì)胞損傷和炎癥損傷發(fā)揮作用，這與清肺抑火中藥的免疫抑制、抗炎和抗氧化等功效具有密切關(guān)系。