橄欖假絲酵母控制蘋果果實青霉病的效果及機制

蔡孟軒，周雅涵，張鴻雁，鄧麗莉，姚世響，曾凱芳*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

蘋果是重要的溫帶水果，由于其生態(tài)適應(yīng)性較強，果品營養(yǎng)價值高，被世界上很多的國家列為主要消費果品[1-2]。但其在采后貯運過程中會受到多種真菌侵染而腐爛變質(zhì)，其中由擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是常見的病害之一[3-5]。P. expansum是產(chǎn)展青霉素的主要菌種，主要通過侵染的方式導(dǎo)致果實腐爛[6]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，展青霉素具有致畸、致癌和免疫毒性，且能夠引起一系列急、慢性疾病甚至細胞水平的突變，對人體具有一定的危害作用[7]。目前，化學(xué)殺菌劑是控制蘋果采后青霉病的主要方式之一，如多菌靈、甲基托布津、苯來特、噻苯咪唑等，但化學(xué)殺菌劑的長期使用對人類健康和環(huán)境造成了一定的危害，且會導(dǎo)致微生物產(chǎn)生抗藥性，從而降低防治效果[8]；因此尋找一種新型的防治蘋果采后青霉病的技術(shù)手段尤為必要。

利用拮抗微生物控制果蔬采后病害是近年來的研究熱點[9]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在果蔬采后病害控制中具有較好效果的酵母大約有20多種，其主要為假絲酵母屬（Candida）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、畢赤酵母屬（Pichia）、黏紅酵母屬（Rhodotorula）和絲孢酵母屬（Trichosporon）等[9-12]。相關(guān)的研究表明，假絲酵母屬能有效抑制蘋果采后灰霉病[13-14]、柑橘青霉病和綠霉病[15-16]、桃果實軟腐病[17]等的發(fā)生。其中齊藤假絲酵母（Candida saitoana）[18-19]和假絲酵母菌CWW-4菌株[20]在病害控制和拮抗機理方面已被研究得較為清楚。Guerrero等[21]研究發(fā)現(xiàn)，橄欖假絲酵母（Candida oleophila）對蘋果青霉病具有一定的抑制作用，且這種抑制作用可能與果實抗性相關(guān)酶活力變化有關(guān)，但目前關(guān)于其對蘋果青霉病的生防機制研究還不夠系統(tǒng)和深入。因此本實驗以蘋果為實驗材料，采用C. oleophila對蘋果果實進行處理，研究不同處理模式下C. oleophila對蘋果青霉病的控制效果，并通過分析離體條件下C. oleophila對青霉菌的抑制作用、C. oleophila在蘋果果實傷口處的生長情況以及果實傷口周圍抗性相關(guān)酶活力的變化，初步探討C. oleophila控制蘋果P. expansum發(fā)病的機制，為蘋果青霉病的生物防治提供一定的理論參考，也為生防酵母的應(yīng)用提供了技術(shù)支持和理論指導(dǎo)，從而減少化學(xué)殺菌劑的使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

P. expansum分離自發(fā)病蘋果果實。采用組織分離法從發(fā)病蘋果果實上分離病原菌，并根據(jù)致病性檢測結(jié)果、病原菌菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果鑒定為P. expansum。

C. oleophila分離自重慶北碚歇馬鎮(zhèn)馮家槽柑橘樹（錦橙447）葉片表面[22]，根據(jù)分子生物學(xué)鑒定結(jié)果鑒定為C. oleophila。

‘紅富士’蘋果產(chǎn)自甘肅靜寧，取大小均一、無機械傷、成熟度基本一致的果實作為實驗材料。

葡萄糖、瓊脂粉、酵母浸膏、牛肉膏、次氯酸鈉成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；BS-4G振蕩培養(yǎng)箱 金壇市富華儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6000真空干燥箱、HWS-28數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PSX-280手提式高壓殺菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；XB.K.25型血球計數(shù)板 上海求精生化試劑有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；SL602N高精顯電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；S-4800掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、E-1045型離子濺射儀 日本Hitachi公司；PowerPac電泳儀 美國Bio-Rad公司；G:BOX EF凝膠成像儀英國Syngene公司；SYNERGYH1MG全自動酶標(biāo)儀美國BioTek公司。

1.3 方法。

1.3.1 C. oleophila懸浮液的制備

懸浮液制作：1）活化菌種：28 ℃條件下，在NYDA培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)C. oleophila 48 h；2）液體培養(yǎng)：挑取一環(huán)NYDA培養(yǎng)基上的C. oleophila于NYDB培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃搖床中培養(yǎng)24 h；3）離心濃縮：4 000 r/min、4 ℃離心10 min，用無菌水洗滌2 次；4）血球計數(shù)板計數(shù)后用無菌水稀釋到1×108CFU/mL和1×107CFU/mL備用。

1.3.2 P. expansum孢子懸浮液的制備

P. expansum接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)刮取適量P. expansum，4 層紗布過濾，血球計數(shù)板計數(shù)，并用無菌水調(diào)整濃度至1×104孢子/mL的孢子懸浮液，待用[23]。

1.3.3 C. oleophila對蘋果果實接種發(fā)病率和病斑直徑影響的測定

同孔接種和異孔接種實驗：將果實隨機分為2 組。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離打孔（直徑3 mm、深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口，每個處理組果實傷口處分別加入20 μL下述液體：無菌水（陽性對照）、1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液。同孔處理：4 h后，在果實傷口處接入20 μL的1×104孢子/mL P. expansum孢子懸浮液。異孔處理：24 h后，在每個傷口右側(cè)5 mm打一個同樣大小的孔，在新孔中加入20 μL的1×104孢子/mL P. expansum孢子懸浮液。

浸泡接種實驗：將果實隨機分成2 組。將果實浸泡于下述液體：無菌水（陽性對照）、1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液；2 min后自然晾干。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離地打傷口（直徑3 mm，深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口。24 h后，每個傷口處分別加入20 μL的1×105孢子/mL P. expansum孢子懸浮液。

待菌液吸收后，單果包裝，置于25 ℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，定期統(tǒng)計果實發(fā)病率和病斑直徑。發(fā)病率的計算如下式。每組處理5 個果實，實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 離體條件下C. oleophila對P. expansum的抑菌作用測定

1.3.4.1 平板對峙實驗

用無菌打孔器在裝有20 mL PDA培養(yǎng)基的平板（直徑為90 mm）上打兩個相距40 mm、直徑10 mm的小孔。在兩組培養(yǎng)基的一孔內(nèi)分別加入0.l mL的無菌水（陽性對照）和1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液。在另一孔內(nèi)均加入20 μL濃度為1×106孢子/mL的P. expansum孢子懸浮液，進行平板對峙實驗。每組處理3 個培養(yǎng)皿，用Parafilm膜密封后置于25 ℃下培養(yǎng)，20 d后觀察拮抗菌與病原菌的生長情況，實驗重復(fù)3 次[24]。

1.3.4.2 C. oleophila揮發(fā)性物質(zhì)對P. expansum的抑制作用測定

采用平板對扣法。吸取100 μL的無菌水（陽性對照）和1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液，分別涂布于NYDA培養(yǎng)基平板上。將平板至于28 ℃培養(yǎng)48 h后，在另一個PDA平板中央接入1 μL 1×106孢子/mL的P. expansum孢子懸浮液，兩板對扣用Parafilm膜密封，置于25 ℃下培養(yǎng)20 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。每組處理3 個培養(yǎng)皿，實驗重復(fù)3 次[25]。

1.3.5 C. oleophila處理后酵母在蘋果果實的生長情況測定

1.3.5.1 C. oleophila接種處理后酵母在蘋果果實傷口處的生長動態(tài)測定

傷口接種處理：將果實隨機分成2 組，接種處理方法同1.3.3節(jié)同孔接種法。待菌液吸收后，單果包裝，貯藏在25 ℃、相對濕度90%～95%環(huán)境下，以接種后1 h測定的酵母菌數(shù)為起始值，每天取一次樣，用稀釋平板法測定酵母數(shù)目。取樣時，用消毒的打孔器取傷口處直徑為10 mm的果肉組織10 份，放入含10 mL無菌水的消毒研缽內(nèi)研磨至勻漿，25 ℃條件下培養(yǎng)48 h后計數(shù)，結(jié)果以每傷口處酵母數(shù)量為單位（lg（cells/wound））表示，每個重復(fù)5 個果實，實驗重復(fù)3 次[26]。

1.3.5.2 C. oleophila懸浮液浸泡處理后酵母在蘋果果實表皮生長動態(tài)測定

將果實浸泡于濃度為1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液中2 min，自然晾干。單果包裝后，除取樣操作不同外，其他均同1.3.5.1節(jié)。取樣時，用消毒的削皮刀削取蘋果果皮，取2 cm×1 cm的果皮5 份放入含10 mL無菌水的消毒研缽內(nèi)研磨至勻漿。

1.3.5.3 C. oleophila接種處理后酵母在蘋果果實傷口處的定殖情況觀察

傷口接種處理：將果實隨機分成2 組，接種處理方法同1.3.3節(jié)同孔接種法。待果實晾干后單果包裝，置于25 ℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏24 h。

SEM樣品制備：1）樣品取材：每組取3 個果實，在果實傷口處切下大小約3 mm×3 mm×3 mm的組織小塊；2）固定：將組織小塊保存在0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的pH 6.8、體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液中過夜固定，固定液置于4 ℃冰箱中；3）清洗：用上述相同的磷酸緩沖液漂洗至少2 次，待脫水；4）脫水：分別用30%、50%、70%、85%、95%乙醇各脫水一次，100%乙醇脫水2 次，每次脫水時間為10 min；5）置換：叔丁醇濃度由低至高置換，分別用50%、70%、90%、95%叔丁醇置換一次，100%叔丁醇置換2 次，每次10 min；6）干燥：放入真空干燥箱中干燥，溫度65 ℃，真空度大于0.08 kPa。干燥時間2 h。將干燥的組織塊用雙面膠粘到金屬臺上，用離子濺射儀對金屬臺噴金、鍍膜。7）觀察、照相[27]。

1.3.6 C. oleophila對蘋果果實相關(guān)防御機制酶活力影響的測定

1.3.6.1 樣品處理及取樣

將果實隨機分成2 組，接種處理方法同1.3.3節(jié)同孔接種法。待液體吸收后，單果包裝，貯藏在25 ℃、相對濕度90%～95%環(huán)境下。從第0天開始取樣，每隔24 h進行一次取樣，連續(xù)取樣6 次，取樣部位為蘋果果實打孔傷口周圍1 cm直徑的健康果實組織。每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)30 個果實，實驗重復(fù)3 次。1.3.6.2 過氧化物酶活力的測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照曹建康等[28]的方法并作適當(dāng)改進。于470 nm波長處室溫下測定反應(yīng)3 min的吸光度變化，以每分鐘吸光度變化1為一個酶活力單位（U）。

1.3.6.3 多酚氧化酶活力的測定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測定參照Srivastava等[29]的方法并作適當(dāng)改進。于420 nm波長處室溫下測定反應(yīng)3 min的吸光度變化，以每分鐘吸光度變化1為一個酶活力單位（U）。

1.3.6.4 苯丙氨酸解氨酶活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL）的測定參照Assis等[30]的方法并作適當(dāng)改進。在室溫下測定保溫（1h）前后290 nm波長處吸光度的變化，每小時每克蘋果吸光度改變0.01定義為一個酶活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Excel 2016軟件統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖；應(yīng)用SPSS 22軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），利用鄧肯氏多重比較對差異顯著性進行分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 C. oleophila對蘋果果實青霉病的控病效果

接種處理后蘋果果實的發(fā)病情況如圖1所示。同孔接種實驗結(jié)果表明，C. oleophila處理組果實的發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對照組果實（P＜0.05），對照組果實在貯藏第4天發(fā)病率達到100%；而在5 d的貯藏期內(nèi)，C. oleophila處理組果實均未發(fā)病，說明C. oleophila可能與P. expansum間存在競爭機制，通過競爭抑制了霉菌的生長。異孔接種實驗結(jié)果表明，第3天和第4天C. oleophila處理組果實的發(fā)病率和病斑直徑均顯著低于對照組果實（P＜0.05）；對照組果實在貯藏第4天發(fā)病率達到100%，而C. oleophila處理組果實在貯藏第5天發(fā)病率達到100%；貯藏第4天時，對照組果實發(fā)病率是C. oleophila處理組的1.32 倍，對照組果實病斑直徑是C. oleophila處理組的1.56 倍；說明拮抗酵母對果實自身抗病相關(guān)系統(tǒng)有一定的誘導(dǎo)作用。浸泡接種實驗結(jié)果表明，C. oleophila處理組果實的發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對照組果實（P＜0.05）；貯藏第4天時，對照組果實發(fā)病率和病斑直徑分別是C. oleophila處理組的3.53 倍和3.77 倍。

圖1 C. oleophila對蘋果果實青霉病發(fā)病率和病斑直徑的影響Fig.1 Effect of C. oleophila on disease incidence and lesion diameter of apple with P. expansum inoculation

2.2 離體條件下C. oleophila對P. expansum的抑菌作用

C. oleophila與P. expansum異孔生長情況如圖2所示。圖2B結(jié)果表明，C. oleophila周圍無抑菌圈，證明C. oleophila不產(chǎn)生抑菌次生代謝產(chǎn)物。

圖2 離體條件下C. oleophila對P. expansum的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of C. oleophila under in vitro culture conditions

2.3 C. oleophila揮發(fā)性物質(zhì)對P. expansum的抑制作用

C. oleophila揮發(fā)性物質(zhì)對P. expansum的抑制作用如圖3所示。與對照組相比，C. oleophila的揮發(fā)性物質(zhì)對P. expansum的生長無顯著抑制作用（P＞0.05）。

圖3 C. oleophila揮發(fā)性物質(zhì)對P. expansum的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of volatile components from C. oleophila on P. expansum

2.4 C. oleophila在蘋果果實上的生長狀況

2.4.1 C. oleophila在蘋果果實上的生長動態(tài)

C. oleophila在蘋果果實上的生長動態(tài)如圖4所示。損傷接種處理后蘋果果實傷口處酵母的生長動態(tài)結(jié)果（圖4A）表明，C. oleophila能在果實傷口處迅速定殖、擴增。在第2天時，C. oleophila在蘋果傷口處的活菌數(shù)達到最高值，比第0天增加了2.24 lg（cells/wound）；4 d后，C. oleophila的活菌數(shù)保持穩(wěn)定。浸泡處理后蘋果果皮處酵母的生長動態(tài)（圖4B）結(jié)果表明，C. oleophila能在蘋果果皮定殖、擴增。在貯藏第2天時，C. oleophila在蘋果果皮處的活菌數(shù)達到最高值；3 d后，C. oleophila的活菌數(shù)雖略有下降，但基本保持穩(wěn)定。

圖4 C. oleophila在蘋果果實傷口處（A）和果皮處（B）的生長動態(tài)Fig.4 Population dynamics of C. oleophila on apple wounds (A) and apple peel (B) after soaking

2.4.2 果實傷口處C. oleophila的生長情況

C. oleophila與病原菌在果實傷口處的生長情況如圖5所示。從圖中可以清晰地看到P. expansum菌絲筆直、粗壯（圖5A）；C. oleophila處理組未能觀察到P. expansum菌絲，C. oleophila在果實傷口處生長旺盛、大量繁殖、形態(tài)清晰、結(jié)構(gòu)完整，果實傷口有大量的酵母附著（圖5B）。

圖5 SEM觀察到的C. oleophila處理組果實傷口處酵母菌的生長情況（×4 000）Fig.5 SEM observation of the growth of C. oleophila on apple wounds (× 4 000)

2.5 C. oleophila對蘋果果實抗病相關(guān)酶活力的影響

2.5.1 C. oleophila對蘋果果實POD和PPO活力的影響

C. oleophila對蘋果果實POD和PPO活力的影響如圖6所示，在5 d的貯藏期內(nèi)，兩個處理組的蘋果果實PPO和POD活力均顯著提高（P＜0.05），總體大致呈先上升后下降的趨勢。與對照組相比，C. oleophila處理組果實的PPO和POD活力增加更明顯，且在接種第2天時，C. oleophila處理組果實的PPO活力約為對照組的1.84 倍，POD活力約是對照組的3.45 倍。

圖6 C. oleophila對果實POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig.6 Effect of C. oleophila inoculation on POD (A) and PPO (B)activities in apple fruits

2.5.2 C. oleophila對蘋果果實PAL活力的影響

圖7 C. oleophila對蘋果果實PAL活力的影響Fig.7 Effect of C. oleophila inoculation on PAL activity in apple fruits

圖7表明，在5 d的貯藏期內(nèi)，蘋果果實的PAL活力總體大致呈先上升后下降再上升的趨勢。C. oleophila處理組蘋果果實的PAL活力顯著高于對照組（P＜0.05），且在接種第2天時，C. oleophila處理組果實的PAL活力約為對照組的2.44 倍。

3 討 論

酵母對果蔬病害的控制機制有多種，酵母可通過營養(yǎng)和空間的競爭，分泌抗生素、揮發(fā)性物質(zhì)等方式來抑制病原菌生長[31-33]，本研究所使用C. oleophila對蘋果青霉病的控制機制也包括多個方面。C. oleophila的抑菌機制主要表現(xiàn)在與病原菌競爭營養(yǎng)和空間，其揮發(fā)性物質(zhì)對青霉菌的生長無顯著抑制作用。本研究中C. oleophila在果實傷口處的生長情況與同孔接種實驗結(jié)果說明營養(yǎng)和空間的競爭是酵母抑菌的主要機制之一。通過觀察C. oleophila在蘋果果實傷口處的生長動態(tài)發(fā)現(xiàn)，C. oleophila能在蘋果果實傷口處迅速定殖、擴增，且在第2天時活菌數(shù)達到最高值，通過SEM圖可以清晰地看到酵母在果實傷口處生長旺盛并大量繁殖，其形態(tài)清晰、結(jié)構(gòu)完整，且果實傷口處有大量的酵母附著。因此，可初步推斷C. oleophila對P. expansum的主要抑菌機制為：C. oleophila在果實傷口迅速生長，果實傷口處的空間被C. oleophila占據(jù)，使P. expansum不能與果實傷口接觸，無法吸收營養(yǎng)物質(zhì)，抑制P. expansum的快速生長繁殖，從而控制果實青霉病的發(fā)生。

異孔損傷接種實驗表明，C. oleophila處理對蘋果青霉病有著較好的控制效果，經(jīng)C. oleophila處理的果實發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對照組果實（P＜0.05）。誘導(dǎo)果實產(chǎn)生抗性是拮抗酵母控制果實病害的主要機制之一[34]。通常拮抗酵母通過誘導(dǎo)蘋果POD、PPO活力的升高，以及木質(zhì)素的大量積累，增加果實抗病性[35]。本實驗結(jié)果表明，當(dāng)用C. oleophila作用于蘋果果實時，在5 d的貯藏期內(nèi)果實PPO、POD活力顯著提高（P＜0.05），且在貯藏第2天達到峰值，分別為對照組的1.84 倍和3.45 倍。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它與植物抗毒素和酚類化合物的形成有著密切的關(guān)系，通過促進次生代謝產(chǎn)物的生成來提高果實的誘導(dǎo)抗病性[36]。在本實驗中，C. oleophila能顯著提高果實的PAL活力（P＜0.05），在貯藏第2天時為對照組的2.44 倍，這與Wisniewski等[8]的研究類似。

浸泡實驗結(jié)果表明，經(jīng)C. oleophila浸泡處理的蘋果果實青霉病的發(fā)病率和病斑直徑都顯著低于對照組（P＜0.05）。同時，本實驗還研究了C. oleophila懸浮液浸泡處理后酵母在蘋果果實表皮生長情況。結(jié)果表明，C. oleophila能在蘋果果皮定殖、擴增；因此推測C. oleophila能夠通過穩(wěn)定附著于蘋果果皮抑制果實青霉病的發(fā)生。

綜上所述，C. oleophila對于抑制蘋果果實青霉病的發(fā)病進程具有較好的效果，其控制蘋果青霉病發(fā)病的機制包括誘導(dǎo)果實產(chǎn)生抗性，以及與病原菌競爭營養(yǎng)和空間。通過比較不同處理模式下C. oleophila對蘋果青霉病的控制效果，發(fā)現(xiàn)C. oleophila在同孔接種處理下比異孔接種處理對蘋果青霉病的發(fā)病進程具有更好的控制作用，并且C. oleophila不能通過分泌抗生素、揮發(fā)性物質(zhì)等方式來抑制P. expansum的生長；說明C. oleophila主要是通過營養(yǎng)與空間競爭抑制蘋果青霉病的發(fā)生。通過浸泡接種的處理方式，模擬實際生產(chǎn)中C. oleophila對蘋果青霉病發(fā)病進程的控制，將蘋果浸泡于C. oleophila懸浮液中，C. oleophila能穩(wěn)定附著于蘋果果皮表面，當(dāng)蘋果受到機械傷時，C. oleophila能夠穩(wěn)定附著于蘋果果皮，從而抑制果實青霉病的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，C. oleophila作為控制果蔬采后病害的生物拮抗菌，其主要通過與病原菌競爭營養(yǎng)成分和空間、提高果蔬抗病相關(guān)酶活性來控制果蔬采后病害的發(fā)生。因此，在實際應(yīng)用過程中可以將C. oleophila與其他物質(zhì)進行復(fù)配以增加酵母在蘋果果皮的數(shù)量，從而增強酵母的生防效果。

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