東北山核桃殼黃酮對小鼠氧化損傷的防御作用

張金堂，沙 迪，夏廣軍，徐紅艷*

（延邊大學農學院，吉林 延吉 133002）

山核桃（Juglans mandshurica），別名核桃楸、胡桃楸，其葉、樹皮、根及果實均可入藥[1-2]，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化等作用[3-4]，在傳統(tǒng)中藥方面應用廣泛。黃酮類化合物廣泛分布于各種植物[5]，具有良好的生物活性[6-7]，能清除生物體內的自由基，同時具有氧化損傷保護作用，又具有很多重要的藥理作用，流行病學調查也顯示，日常餐飲中黃酮類化合物的攝入有益健康并可降低慢性疾病的發(fā)生[8]。

在正常情況下，機體自由基能維持在損傷閾值以下的平衡態(tài)，但很多因素都能造成機體的氧化損傷，如乙醇、H2O2、輻射等，使機體產生過量的自由基，引起氧化應激[9]。盡管有研究表明，哺乳動物的機體具有某些抵抗和減少氧化損傷的防御機制，但活性氧自由基高度活化，能夠破壞脂類、蛋白質和DNA、RNA等生物分子[10]，從而導致癌癥、動脈粥樣硬化、組織器官老化、炎性疾病等的發(fā)生[11]，給人類健康帶來很大的潛在危害。

東北山核桃仁營養(yǎng)價值很高，近年來成為研究和關注的熱點。山核桃殼是加工核桃仁過程中產生的副產物，部分用于加工工藝品或制備活性碳，關于其中活性成分研究報道較少，而有關東北山核桃殼黃酮（flavonoids from seed shells of Juglans mandshurica，F(xiàn)SSJM）氧化損傷防御作用的研究鮮見報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SSJM具有顯著的清除2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和羥自由基作用[12]，基于其顯著的體外抗氧化效果，本研究以東北山核桃殼為原料，提取總黃酮，經(jīng)分級萃取和柱層析純化提高純度，采用X射線制造氧化損傷模型，并通過小鼠體內實驗，采用分光光度法、形態(tài)學法和免疫組化法，進一步探索其體內氧化損傷防御作用，旨在為東北山核桃殼生理活性物質的深入挖掘和堅果加工副產物的應用和產品開發(fā)提供參考及新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雄性SPF級昆明小鼠，體質量（20±2）g，購于延邊大學實驗動物中心。

FSSJM（純度54%）按本課題組前期研究方法制備[12]。

鹽酸小檗胺片（批號：151101） 四川中方制藥有限公司；還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）標準品上海源葉生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；兔抗Bax、Bcl-2美國Cell Signaling Technology公司；鏈霉親和素-生物素復合物（streptavidin-biotin complex，SABC）免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒 美國博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Z400K型速凍離心機 德國Hermle公司；U-3900型紫外-可見分光光度計 日本日立公司；Elekta CompactTM醫(yī)用直線加速器 醫(yī)科達北研（北京）醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠輻射誘導氧化損傷模型的建立

將60 只雄性的昆明小鼠隨機分為6 組，正常組和模型組（0.125%羧甲基纖維素），F(xiàn)SSJM低、中、高劑量組（X射線+100、200、400 mg/（kg·d）），陽性對照組（X射線+鹽酸小檗胺片56 mg/（kg·d））。每3 d測體質量，連續(xù)灌胃14 d后，采用醫(yī)用直線加速器一次性全身X射線照射，源皮距95 cm，劑量吸收率1 Gy/min，照射總劑量4 Gy。

1.3.2 血清及肝勻漿的制備

小鼠X射線照射24 h后，眼球采血，4℃、4 000 r/min離心10 min，上清液4 ℃保存。小鼠處死后迅速取肝臟制成質量分數(shù)10%勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 抗氧化酶活力的測定

小鼠肝臟和血清中SOD、GSH-Px、CAT活力的測定均按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 MDA含量的測定

采用硫代巴比妥酸顯色法，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 GSH標準曲線繪制及含量測定

采用5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）法[13]，分別取1 mmol/L的GSH標準品溶液0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL，加三蒸水至0.5 mL，再分別加4.0 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.5 mL DTNB試劑，充分混勻，5 min內于412 nm波長處測定吸光度，以三蒸水調零，以GSH含量為x軸，吸光度為y軸，繪制標準曲線，方程為y＝0.013 4x-0.002 8，R2＝0.998 3。將制備好的肝勻漿與20%三氯乙酸溶液2∶1（V/V）混勻，4 000×g離心10 min，收集上清液，按標準曲線方法測定，并計算樣品中GSH的含量。

1.3.6 形態(tài)學觀察

X射線照射14 d后處死小鼠，迅速取肝臟，體積分數(shù)10%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明，石蠟包埋，制為5 μm切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后鏡檢。

1.3.7 免疫組化檢測

X射線照射14 d后處死小鼠，迅速取肝臟和脾臟，體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，制為4 μm切片，烤片過夜，脫蠟。然后滴加體積分數(shù)3% H2O2溶液，室溫孵育10 min，PBS清洗；滴加5%牛血清白蛋白封閉液，37℃下孵育20 min，甩干；滴加一抗，4 ℃下孵育過夜，PBS清洗；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗；滴加SABC，37 ℃孵育30 min，PBS清洗；滴加DAB顯色，蘇木精復染2 min，脫水，中性樹膠封片，鏡檢。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 FSSJM對小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA含量的影響

表1 FSSJM對小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA含量的影響Table1 Effect of FSSJM on SOD, GSH-Px and CAT activity and MDA content in serum of mice

由表1可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活力極顯著降低（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），表明輻射誘導的氧化損傷造模成功。與模型組相比，F(xiàn)SSJM中、高劑量組和陽性對照組SOD活力極顯著升高（P＜0.01）；低劑量組和陽性對照組GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），中、高劑量組GSH-Px活力極顯著升高（P＜0.01）；中劑量組CAT活力顯著升高（P＜0.05），高劑量組和陽性對照組CAT活力極顯著升高（P＜0.01）；低劑量組MDA含量顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組和陽性對照組MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。表明FSSJM能夠調節(jié)氧化損傷小鼠血清中抗氧化酶活力，并下調脂質過氧化產物MDA的含量。

2.2 FSSJM對小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA、GSH含量的影響

表2 FSSJM對小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA、GSH含量的影響Table2 Effect of FSSJM on SOD, GSH-Px and CAT activity and MDA and GSH contents in liver of mice

由表2可知，與正常組相比，照射后小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量極顯著降低（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），表明輻射誘導的氧化損傷造模成功。與模型組相比，F(xiàn)SSJM中、高劑量組和陽性對照組的SOD和CAT活力顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）；低劑量組GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），中、高劑量組和陽性對照組GSH-Px活力極顯著升高（P＜0.01）；低劑量組GSH含量顯著升高（P＜0.05），高劑量組和陽性對照組GSH含量極顯著升高（P＜0.01）。表明FSSJM能夠調節(jié)氧化損傷小鼠肝臟中抗氧化酶活性，上調內源性抗氧化物質GSH的含量，并下調脂質過氧化產物MDA的含量。

2.3 FSSJM對小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

圖1 FSSJM對小鼠肝臟組織形態(tài)學變化的影響Fig.1 Effect of FSSJM on morphological changes in liver tissues of mice

如圖1A1～F1所示，與正常組比較，模型組細胞索排列紊亂，細胞受損嚴重，肝細胞大小不一致，出現(xiàn)濃縮壞死現(xiàn)象，導致竇周間隙變大；FSSJM各劑量組均不同程度優(yōu)于模型組，竇周間隙逐漸變小，陽性對照組接近正常組水平。

如圖1A2～F2所示，正常組小鼠肝細胞大小一致，核結構清晰，無明顯病變；模型組肝臟組織細胞損傷嚴重，部分細胞濃縮壞死，界限不清，出現(xiàn)顆粒變性；FSSJM低、中、高劑量組及陽性對照組出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，表明細胞再生，導致細胞腫脹，竇周間隙變窄；與模型組相比，中、高劑量組和陽性對照組細胞索排列整齊，核結構清晰，細胞損傷減少。表明FSSJM能夠明顯改善輻照小鼠肝臟組織的損傷。

2.4 FSSJM對小鼠肝臟Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

如圖2所示，正常組肝臟切片未見棕黃色區(qū)域（圖中未能顯示，下同），為Bax蛋白陰性表達。模型組可見大量棕黃色區(qū)域，且著色較深，為Bax蛋白強陽性表達。與模型組相比，F(xiàn)SSJM低、中劑量組Bax蛋白陽性細胞明顯減少，高劑量組和陽性對照組Bax陽性細胞進一步減少，且著色較淺、分布均勻，為Bax蛋白陰性表達。表明FSSJM可下調輻射誘導的氧化損傷小鼠肝細胞Bax蛋白的表達。

圖2 FSSJM對小鼠肝臟組織Bax蛋白的影響Fig.2 Effect of FSSJM on Bax protein expression in liver tissues of mice

圖3 FSSJM對小鼠肝臟組織Bcl-2蛋白的影響Fig.3 Effect of FSSJM on Bcl-2 protein expression in liver tissues of mice

如圖3所示，正常組小鼠肝臟組織可見大量棕黃色的Bcl-2陽性細胞，且著色較深，為強陽性表達；模型組肝臟組織棕黃色明顯變淡，為Bcl-2蛋白弱陽性表達；與模型組相比，F(xiàn)SSJM中、高劑量組和陽性對照組可見較大面積棕黃色顆粒，為Bcl-2蛋白陽性表達。表明FSSJM可上調輻射誘導的氧化損傷小鼠的肝細胞Bcl-2蛋白的表達。

2.5 FSSJM對小鼠脾臟Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

圖4 FSSJM對小鼠脾臟組織Bax蛋白的影響Fig.4 Effect of FSSJM on Bax protein expression in spleen tissues of mice

如圖4所示，正常組脾臟組織未見棕黃色區(qū)域，是Bax蛋白陰性表達。模型組可見大量棕黃色區(qū)域，且著色較深，為Bax蛋白強陽性表達。與模型組比較，F(xiàn)SSJM低、中、高劑量組和陽性對照組Bax蛋白陽性細胞不同程度地減少。表明FSSJM可下調輻射誘導的氧化損傷小鼠脾臟細胞Bax蛋白的表達。

圖5 FSSJM對小鼠脾臟組織Bcl-2蛋白的影響Fig.5 Effect of FSSJM on Bcl-2 protein expression in spleen tissues of mice

如圖5所示，正常組小鼠脾臟組織可見大量棕黃色區(qū)域，為Bcl-2蛋白強陽性表達；模型組肝臟組織僅有少數(shù)棕黃色細胞，為弱陽性表達；與模型組相比，F(xiàn)SSJM低、中、高劑量組和陽性對照組均可見不同面積的棕黃色區(qū)域。表明FSSJM可上調輻射誘導的小鼠脾臟細胞Bcl-2蛋白表達。

3 討 論

X射線照射可電離機體內的水分子，產生過量自由基，使細胞發(fā)生氧化損傷[14]，導致機體發(fā)生不同程度的病理和生化方面的改變[15]，近幾年成為氧化損傷研究中的造模方法之一[16]，照射后，機體中抗氧化酶活力降低，脂質過所化產物含量升高[17]。SOD、GSH-Px和CAT是機體抗氧化酶系統(tǒng)清除氧自由基重要的酶[18]。GSH是反映非酶類抗氧化防御系統(tǒng)狀態(tài)的一種多能防護物質[19]；MDA是脂質過氧化作用的最終產物[20]。本研究中，模型組血清和肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量均顯著低于正常組，MDA含量極顯著高于正常組，與Bansal等[21]報道的小鼠照射后模型組CAT、SOD活力顯著低于正常組、模型組MDA含量高于正常組的結果一致，表明小鼠氧化損傷模型構建成功。

醫(yī)學研究證實，心血管疾病、腫瘤和衰老均與氧化損傷及自由基代謝失調有關。近幾年天然植物活性物質在氧化應激的防護中逐步得到重視，植物黃酮作為具有強抗氧化作用的多酚類物質，顯現(xiàn)出良好的效果。研究表明，黃酮類化合物對X射線、60Co γ射線誘導的氧化損傷都表現(xiàn)出顯著的保護作用[16,22]，可提高輻射后機體內源性抗氧化酶SOD、CAT及GSH-Px的活力、減少DNA損傷和對輻射敏感細胞的凋亡、降低細胞微核率，并調節(jié)機體氧化還原作用敏感通路[23]，發(fā)揮良好的氧化損傷保護作用。本研究中，F(xiàn)SSJM可減緩X射線照射小鼠體質量的下降，不同程度地提高X射線照射小鼠體內的SOD、GSH-Px、CAT活力，降低MDA含量，增加內源抗氧化物質GSH的含量，從而使小鼠體內抗氧化能力得到增強，這與王文君等[24]的蘆薈黃酮體內抗氧化活性的研究結果一致。表明FSSJM對輻射誘導的氧化損傷小鼠的抗氧化酶系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)都具有一定的保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)，輻射會導致肝臟組織的退行性變化[25]。本研究顯示FSSJM各劑量組的肝臟組織與模型組相比均得到不同程度的修復，與陳純琦[26]研究的蕓豆芽菜多酚修復過氧化損傷小鼠肝臟的結果基本一致。Bax是促凋亡因子，Bcl-2能夠與自身或Bax分別形成同二聚體和異二聚體，從而對細胞的凋亡過程進行抑制[27]。研究顯示，X射線照射會上調Bax蛋白表達、下調Bcl-2蛋白表達，促使細胞凋亡，而植物黃酮具有下調Bax蛋白和上調Bcl-2蛋白表達的作用[28]。本研究中模型組肝臟、脾臟細胞Bax蛋白高表達，Bcl-2蛋白低表達，F(xiàn)SSJM各劑量組肝臟、脾臟細胞Bax蛋白表達明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達明顯高于模型組，表明FSSJM通過下調Bax和上調Bcl-2蛋白表達，抑制細胞凋亡，從而有效保護小鼠肝臟和脾臟細胞遭受氧化損傷。

以上結果表明，F(xiàn)SSJM通過調節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)的機能、抑制細胞凋亡、修復受損的肝臟和脾臟組織而發(fā)揮氧化損傷的防御作用。

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