• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雞卵類黏蛋白過敏原性的在體與離體實驗

    2018-03-20 03:30:08王麗娟吳子健陳一華裴高鑫
    食品科學(xué) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:豚鼠離體動物模型

    王麗娟,吳子健,劉 露,陳一華,裴高鑫,王 勇

    (1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134;2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室,天津 300134)

    雞蛋具有豐富的營養(yǎng)價值,是最物美價廉的食物之一,也是嬰幼兒早期主要的膳食蛋白來源,還是許多加工食品的主要組成成分。然而,雞蛋也是易引起過敏的常見食物之一[1-2]。從雞蛋的營養(yǎng)價值和食品安全的角度考慮,開發(fā)低致敏性或無致敏性的蛋類食品十分必要。動物實驗是評價食品潛在致敏性最直接的方法[3]。因此,建立可靠的過敏動物模型是檢測食品過敏原的重要環(huán)節(jié)。卵類黏蛋白是雞蛋過敏反應(yīng)中致敏性最強、最普遍的蛋白質(zhì)[1,4-5],而研究卵類黏蛋白在體致敏性的動物模型鮮見明確報道。本實驗選擇豚鼠為研究對象,以卵白蛋白為陽性對照,以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)為陰性對照[6],通過比較卵類黏蛋白與卵白蛋白的全身過敏反應(yīng)和對致敏豚鼠離體腸平滑肌收縮反應(yīng)(Schultz-Dale反應(yīng))的影響,建立卵類黏蛋白過敏實驗的整體實驗和離體器官實驗的動物模型,為深入研究卵類黏蛋白過敏及進一步開發(fā)與評價低敏或無致敏性蛋類食品中過敏原的消減效果提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    英國種Hartly豚鼠(白色),2~3 月齡,體質(zhì)量250~320 g,雌雄兼用,清潔級,由天津市實驗動物中心提供;合格證號:SCXK津2010-0002。雌雄分籠飼養(yǎng),自由攝食、飲水,室溫(20~25 ℃),光線充足。

    卵類黏蛋白(純度>94%) 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室;卵白蛋白(純度≥90%,Ⅱ型)美國Sigma公司;羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)杭州華安生物技術(shù)有限公司;丙酮(分析純) 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司;馬來酸氯苯那敏(撲爾敏,批號140103) 黑龍江百泰藥業(yè)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    BL-420F生物信號采集系統(tǒng)、HW-1000超級恒溫水浴成都泰盟軟件有限公司;Spectra Max 190光吸收酶標(biāo)儀美國美谷分子儀器有限公司;2000ES全自動四元梯度高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀(配套UV1000紫外檢測儀) 美國SSI/Alltech公司;TDZ4-WS臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 卵類黏蛋白的制備

    采用三氯乙酸丙酮工藝提取卵類黏蛋白[7]。在規(guī)定的實驗條件下,手工分離蛋清和蛋黃,將蛋清進行預(yù)處理降低黏度。向蛋清中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)10%三氯醋酸溶液并混合均勻,調(diào)節(jié)pH 4.0,4 ℃靜置4 h。4 ℃、4 000 r/min離心15 min后取上清液加入3 倍體積預(yù)冷丙酮,在冰浴里放置至少4 h。再次離心后取上清液用水稀釋,調(diào)節(jié)至pH 4.0,加入3 倍體積預(yù)冷丙酮,冰浴中靜置4 h以上。4 ℃、4 000 r/min離心15 min后將上清液透析凍干即得卵類黏蛋白,經(jīng)HPLC檢測,純度≥94%。

    1.3.2 過敏性休克動物模型的建立

    實驗前期,豚鼠在實驗室適應(yīng)1 周,將30 只健康合格豚鼠按體質(zhì)量隨機分為5 組,每組6 只,雌雄各半。各組的致敏與激發(fā)物質(zhì)分別為PBS、1 mg/mL卵白蛋白、1、2、4 mg/mL卵類黏蛋白。致敏方法為腹腔注射,每只注射1.0 mL,隔日1 次,共3 次,于末次腹腔注射后第10天進行激發(fā)。激發(fā)時豚鼠行靜脈注射,2.0 mL/只,非一次注射成功者舍棄[6,8]。激發(fā)后立即觀察并記錄60 min內(nèi)豚鼠的反應(yīng)[9],觀察指標(biāo)及過敏反應(yīng)評定方法[6,8]見表1。

    表1 豚鼠過敏反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)Table1 Criteria for systemic allergic reaction assessment in guinea pig

    1.3.3 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏原攻擊實驗

    將25 只豚鼠按體質(zhì)量隨機分為5 組,每組5 只。分組情況及致敏方法同1.3.2節(jié)。末次注射后第14天進行腸平滑肌過敏原攻擊實驗(Schultz-Dale反應(yīng))。取致敏豚鼠,放血處死,取出回腸一段,按離體器官裝置進行安裝并描記,浴管內(nèi)均加入25 mL臺氏液,并保持恒溫、供氧。待腸平滑肌收縮活動平穩(wěn)后,用相應(yīng)過敏原攻擊,觀察并記錄攻擊前后的腸收縮曲線。比較各組腸收縮力的變化,根據(jù)下式計算腸收縮變化率[9]。

    式中:F0為攻擊前的腸平滑肌收縮力/g;F1為攻擊后的腸平滑肌收縮力/g。

    1.3.4 撲爾敏對卵類黏蛋白致敏作用的影響

    0.16 μg/mL撲爾敏對組胺即有明顯的阻斷作用[6]。豚鼠致敏方法同1.3.2節(jié)。于末次致敏后第14天進行Schultz-Dale反應(yīng)檢測,離體腸段處置方法同1.3.3節(jié)。待腸平滑肌收縮活動平穩(wěn)后,首先給予0.16 μg/mL撲爾敏,觀察腸段的變化,待腸收縮穩(wěn)定后再加入相應(yīng)的過敏原進行攻擊,通過比較給予撲爾敏前后腸收縮力的變化,分析腸平滑肌的過敏反應(yīng)與組胺釋放的關(guān)系。

    1.3.5 間接ELISA法測定血清抗體效價

    豚鼠致敏方法同1.3.2節(jié)。末次致敏第14天,自頸總動脈放血至離心管中,靜置10 min后3 000 r/min離心5 min得到血清,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    按間接酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-l i n ke d immunosorbent assay,ELISA)步驟操作[10]。經(jīng)測試,包被抗原的最佳工作質(zhì)量濃度為20 μg/mL,酶標(biāo)抗抗體(二抗)選擇羊抗兔IgG-HRP,底物選擇鄰苯二胺。終止反應(yīng)后立即用酶標(biāo)儀測定,在492 nm波長處測定不同稀釋倍數(shù)待測卵類黏蛋白致敏豚鼠血清的OD值,每個樣品平行測3 次,取平均值。以陽性O(shè)D值為陰性對照2 倍時血清的稀釋倍數(shù)為抗體效價。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 卵類黏蛋白的過敏性休克反應(yīng)

    根據(jù)激發(fā)后豚鼠的反應(yīng),按表1中的評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分,各組的評分結(jié)果見表2。

    表2 豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果Table2 Evaluation of systemic allergic reactions in guinea pig

    由表2可以看出,PBS溶液(陰性對照)組的過敏率為0,1 mg/mL卵白蛋白(陽性對照)組豚鼠100%出現(xiàn)了過敏反應(yīng),并因過敏性休克而死亡,表現(xiàn)過敏反應(yīng)極強陽性,評分達(dá)4分。1~4 mg/mL卵類黏蛋白各組豚鼠也出現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng),其反應(yīng)強度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,即隨致敏和激發(fā)劑量增加,過敏反應(yīng)程度加強。4 mg/mL卵類黏蛋白與1 mg/mL卵白蛋白的致敏性相近(P>0.05)。

    2.2 Schultz-Dale反應(yīng)

    于末次致敏第14天進行過敏原攻擊實驗,攻擊時均加入相應(yīng)過敏原0.2 mL,結(jié)果見表3。

    表3 卵類黏蛋白對豚鼠離體腸平滑肌的作用Table3 Effects of ovomucoid on the isolated ileum smooth muscle from the guinea pig

    剪輯各組腸收縮曲線,結(jié)果見圖1。

    圖1 致敏腸平滑肌在過敏原攻擊前后的收縮曲線Fig.1 Contraction curves of isolated ileum smooth muscle before and after allergic attack

    由圖1可知,PBS組在攻擊后無明顯反應(yīng)(且存在run-down現(xiàn)象),1 mg/mL卵白蛋白組攻擊后的腸平滑肌收縮幅度較攻擊前明顯加大(P<0.01);1~4 mg/mL卵類黏蛋白各組受攻擊后的腸平滑肌收縮力較攻擊前也明顯加強(P<0.01),與1 mg/mL卵白蛋白組的反應(yīng)相近(P>0.05),表明卵類黏蛋白具有強致敏性。不同質(zhì)量濃度卵類黏蛋白組間比較,2 mg/mL卵類黏蛋白對致敏腸平滑肌的攻擊作用強于1 mg/mL卵類黏蛋白組,而4 mg/mL卵類黏蛋白的攻擊作用有所減弱,這可能是隨卵類黏蛋白過敏原致敏劑量加大,致敏性增強,使其在致敏強化期間就有部分過敏活性物質(zhì)釋放,引起腸平滑肌的基礎(chǔ)張力增高,致使在過敏原攻擊后的收縮力增強幅度減小(表3、圖1)。

    2.3 卵類黏蛋白致敏豚鼠血清抗體效價

    用20 μg/mL包被抗原包被酶標(biāo)板,加入不同稀釋度的各待測血清,酶標(biāo)儀測定OD492nm,計算抗體效價,結(jié)果致敏劑量為1、2 mg/mL和4 mg/mL的卵類黏蛋白各組豚鼠,其血清IgG效價分別為64、96和192,其致敏豚鼠血清的抗體效價水平與其過敏的臨床表現(xiàn)趨勢相一致,具有劑量依賴關(guān)系。

    2.4 卵類黏蛋白致敏類型的初步分析

    表4 撲爾敏對卵類黏蛋白過敏原致敏作用的影響Table4 Blocking effect of chlorphenamine on the sensitization efficiency of ovomucoid

    在Schultz-Dale反應(yīng)實驗中,預(yù)先給予撲爾敏,則卵類黏蛋白的攻擊作用明顯被拮抗,結(jié)果見表4和圖1F。攻擊前、后腸平滑肌收縮力差異不顯著(P>0.05),2 mg/mL卵類黏蛋白與4 mg/mL卵類黏蛋白組差異也不顯著(P>0.05)。提示組胺的釋放在卵類黏蛋白致敏過程中起重要作用,卵類黏蛋白引起的過敏反應(yīng)極大可能是由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。

    3 討 論

    過敏癥是在全世界廣泛流行的一類常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病。由于其種類繁多,臨床表現(xiàn)復(fù)雜,危害廣泛且難以根治,成為長期以來醫(yī)學(xué)界的一大難題[11]。食物過敏是常見的食物不良反應(yīng)之一,多數(shù)食物過敏為由IgE介導(dǎo)的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。

    食物過敏的實驗研究方法分整體動物體內(nèi)實驗、哺乳動物離體器官實驗和體外檢測過敏原實驗。體外檢測不能反映食物進入體內(nèi)的過敏反應(yīng)進程,具有很大的局限性,而人體實驗又存在安全與倫理方面的問題。因此,哺乳動物體內(nèi)實驗與離體器官實驗是評價食品安全性的主要研究手段。食物過敏動物模型則是評價新型食物或蛋白潛在致敏性主要的也是最直接的研究方法[12-13],可直接、準(zhǔn)確地反映食物中過敏原的存在與否。然而,研究食物過敏的動物模型還不夠成熟,也不穩(wěn)定,不同動物對食物中過敏原的過敏反應(yīng)存在量與質(zhì)的差異。目前,常用于食物過敏模型研究的動物主要有小鼠(ICR小鼠[14]、BALB/c小鼠[15-17]、C3H/HeJ小鼠[18]等)、大鼠(BN大鼠[19-21])、豚鼠[5,22]、幼豬[23]、狗[24]等。各種動物對不同過敏原的反應(yīng)性有所差異,其反應(yīng)與過敏原的性質(zhì)、純度等因素有關(guān)[25]。豚鼠血清中含有豐富的補體,易于致敏,與其他動物相比,具有與人類相似的過敏原識別機制,更適于進行過敏性實驗研究[26-27]。

    雞蛋是引發(fā)食物過敏最常見的食物之一。雞蛋中有4 種主要過敏原(卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶),其中卵類黏蛋白是雞蛋過敏反應(yīng)中致敏性最強、最普遍的蛋白質(zhì)之一[4,25]。雞蛋中的4 種主要過敏原中,卵白蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)等已研究的較為透徹,并容易獲得。因此,在很多研究中,已將其作為建立食物過敏動物模型中的對照品[28-29]。目前,關(guān)于卵類黏蛋白過敏實驗動物模型的研究尚鮮見明確的報道。

    本研究結(jié)果顯示,1 mg/mL卵清白蛋白即可使豚鼠100%致敏并出現(xiàn)過敏性休克死亡,與文獻[6,27-28]報道相符。卵類黏蛋白引起的過敏性休克反應(yīng)與卵清白蛋白相似,且不同劑量卵類黏蛋白的過敏反應(yīng)呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。即增加過敏原的接觸劑量,過敏反應(yīng)陽性率增加,過敏反應(yīng)程度加重;降低劑量到一定水平,陽性率也大大降低,與藥物過敏反應(yīng)的發(fā)生比較一致,確證了過敏反應(yīng)與卵類黏蛋白間的因果關(guān)系。Schultz-Dale反應(yīng)是觀察和評價Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)常用的方法。致敏動物的腸平滑肌在抗原攻擊時釋放過敏介質(zhì),使平滑肌收縮。通過比較過敏原攻擊前后的腸平滑肌收縮力,分析過敏原的致敏性。卵類黏蛋白與卵白蛋白的Schultz-Dale反應(yīng)結(jié)果與全身過敏反應(yīng)趨勢相似。組胺是一種自體活性物質(zhì),在暴露的抗原反應(yīng)中,組胺釋放后進入組織[30],然后與外周組胺H1受體結(jié)合,引起呼吸道和胃腸道中速發(fā)濃度依賴的平滑肌收縮[11]。撲爾敏為組胺H1受體拮抗劑,能對抗由組胺引起的上述反應(yīng)。本研究結(jié)果提示卵類黏蛋白引起的過敏反應(yīng)可能為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。間接ELISA法測定卵類黏蛋白致敏豚鼠血清抗體的效價水平與在體、離體器官實驗結(jié)果相一致。

    綜上,選擇豚鼠為觀察對象,以卵白蛋白為對照建立的卵類黏蛋白過敏實驗動物模型是可靠的,結(jié)合間接ELISA法檢測血清抗體水平,結(jié)果將更加可靠。

    [1] MINE Y, ZHANG J W. The allergenicity of ovomucoid and the effect of its elimination from hen’s egg white[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(15): 1540-1546. DOI:10.1002/jsfa.974.

    [2] 趙水娣, 賈寧人, 李思洋. 食物變態(tài)反應(yīng)性疾病患者食物過敏原特異性IgG抗體檢測結(jié)果分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(5):606-607. DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2012.05.048.

    [3] 單毓娟. 食品毒理學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2013: 140.

    [4] MINE Y, ZHANG J W. Identification and fine mapping of IgG and IgE epitopes in ovomucoid[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002, 292(4): 1070-1074. DOI:10.1006/bbrc.2002.6725.

    [5] 李燦鵬, 吳子健. 蛋品科學(xué)與技術(shù)[M]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2013:1-2.

    [6] 王麗娟, 胡志和, 陳照麗, 等. 蝦蛋白過敏實驗動物模型的建立[J].食品科學(xué), 2010, 31(19): 347-350.

    [7] 史曉霞. 蛋清卵類黏蛋白分離純化、結(jié)構(gòu)表征極其過敏原性的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 24-26. DOI:10.7666/d.Y2162153.

    [8] PARK J S, CHOI I H, LEE D G, et al. Anti-IL-4 monoclonal antibody prevents antibiotics-induced active fatal anaphylaxis[J]. Journal of Immunology, 1997, 158(10): 5002-5006.

    [9] 徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實驗方法學(xué)[M]. 3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2003: 237-238; 1411-1412.

    [10] TONG P, GAO J, CHEN H, et al. Effect of heat treatment on the potential allergenicity and conformational structure of egg allergen ovotransferrin[J]. Food Chemistry, 2012, 131(2): 603-610.DOI:10.1016/j.foodchem.2011.08.084.

    [11] 張駿, 翁福海. 保肺祛敏沖劑抗過敏介質(zhì)實驗及抗乙酰膽堿收縮豚鼠離體回腸實驗研究[J]. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 1999, 5(4): 69-70.

    [12] Food and Agriculture Organization. Evaluation of allergenicity of genetically modif i ed foods[R/OL]. (2001-01-22)[2016-11-15]. http://www.fao.org/docrep/007/y0820e/y0820e00.htm.

    [13] GOODMAN R E,VIETHS S,SAMPSON H A, et al. Allergenicity assessment of genetically modified crops: what makes sense?[J].Nature Biotechnology, 2008, 26(1): 73-81. DOI:10.1038/nbt1343.

    [14] 蔣棟磊, 孫秀蘭, 張銀志, 等. 小鼠過敏模型在食品過敏原分析中的研究與應(yīng)用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2012, 31(5): 499-504.DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2012.05.009.

    [15] DEARMAN R J, KIMBER I. Characterization of antibody responses induced in rodents by exposure to food proteins: inf l uence of route of exposure[J]. Toxicology, 2001, 167(3): 217-231. DOI:10.1016/so300-483x(01)00462-0.

    [16] DEARMAN R J, KIMBER I. A mouse model for food allergy using intraperitoneal sensitization[J]. Methods, 2007, 41(1): 91-98.DOI:10.1016/j.ymeth.2006.07.008.

    [17] CHANG L, SAMPSON H A, MASILAMANI M. Oral sensitization to peanut in BALB/c mice is enhanced by dietary elimination of soybean components-towards a better mouse model for food allergy[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2013, 131(2): 218. DOI:10.1016/j.jaci.2012.12.1447.

    [18] 孫拿拿, 張馨, 崔文明, 等. 食品致敏性評價嚙齒類動物模型研究-C3H/HeJ小鼠動物模型[J]. 衛(wèi)生研究, 2010, 39(3): 310-312.

    [19] 孫拿拿, 張倩男, 王珊, 等. BN大鼠經(jīng)口致敏動物模型研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2013, 25(3): 214-217.

    [20] 呂相征, 劉秀梅, 楊曉光. BN大鼠食物過敏動物模型的實驗研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2005, 17(2): 103-105. DOI:10.3969/j.issn.1004-8456.2005.02.003.

    [21] 李中港, 秦慧迪, 汪懷山, 等. BN大鼠與Wistar大鼠Ⅰ型超敏反應(yīng)敏感性的比較[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2010, 24(1): 30-34.DOI:10.3867/j.issn.1000-3002.2010.01.006.

    [22] 向軍儉, 李小迪, 王宏, 等. 過敏癥豚鼠模型的建立及海蝦主要過敏原組分的純化與鑒定[J]. 食品科技, 2006, 31(6): 137-140.DOI:10.3969/j.issn.1005-9989.2006.06.043.

    [23] 黃瓊, 徐海濱, 高芃, 等. 大豆球蛋白經(jīng)口誘發(fā)五指山小型豬過敏反應(yīng)的實驗研究[J]. 衛(wèi)生研究, 2009, 38(5): 531-534.

    [24] TWUBER S S, DELVAL G, MORIGASKI S, et al. The atropic dog as a model of peanut and tree nut food allergy[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2002, 110(6): 921-927. DOI:10.1067/mail.2002.130056.

    [25] BETTY C, MARJAN G, HANS W, et al. Sensitizing capacity and allergenicity of enzymatically cross-linked sodium caseinate in camparison to sodium caseinate in a mouse model for cow’s milk allergy[J]. Toxicology Letters, 2013, 218(1): 50-55. DOI:10.1016/j.toxlet.2013.01.001.

    [26] 崔淑芳. 實驗動物學(xué)[M]. 上海: 第二軍醫(yī)大學(xué)出版社, 2007: 123.

    [27] 王朋, 譚程, 張佳佳, 等. 經(jīng)卵清蛋白致敏過敏性鼻炎模型豚鼠造模方法探討[J]. 臨床誤診誤治, 2012, 25(3): 32-35. DOI:10.3969/j.issn.1002-3429.2012.03.020.

    [28] WALSH B J, HILL D J, MACOUN P, et al. Detection of four distinct groups of hen egg allergens binding IgE in the sera of children with egg allergy[J]. Allergologia et Immunopathologia, 2005, 33(4): 183-191. DOI:10.1157/13077741.

    [29] 李凱文, 邵潔. 雞蛋過敏原與嬰幼兒雞蛋過敏的研究進展[J]. 臨床兒科雜志, 2011, 29(4): 386-389. DOI:10.3969/j.issn.1000-3606.2011.04.026.

    [30] 向軍儉, 張在軍, 毛露田, 等. 食品過敏源體外激發(fā)小鼠致敏肥大細(xì)胞組胺釋放[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2005, 26(5): 593-595.

    猜你喜歡
    豚鼠離體動物模型
    肥胖中醫(yī)證候動物模型研究進展
    胃癌前病變動物模型復(fù)制實驗進展
    潰瘍性結(jié)腸炎動物模型研究進展
    《豚鼠特工隊》:身懷絕技的動物007
    長白落葉松離體再生體系的建立
    切花月季‘雪山’的離體快繁體系的建立
    靈魂離體
    奧秘(2016年10期)2016-12-17 13:13:11
    肺豚鼠耳炎諾卡菌病1例
    糖尿病性視網(wǎng)膜病變動物模型研究進展
    做瑜伽的小豚鼠
    軍事文摘(2015年6期)2015-06-16 08:47:58
    av天堂中文字幕网| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩中字成人| 美女主播在线视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产 亚洲一区二区三区 | 一级毛片 在线播放| 欧美精品国产亚洲| 丰满乱子伦码专区| 青青草视频在线视频观看| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲综合精品二区| 老司机影院成人| 精品人妻熟女av久视频| 成人二区视频| 中文在线观看免费www的网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美+日韩+精品| av天堂中文字幕网| 久久热精品热| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩三级伦理在线观看| 日韩强制内射视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产精品久久久久久精品电影小说 | 免费无遮挡裸体视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 99热网站在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美一区二区亚洲| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲成人久久爱视频| 91精品国产九色| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩欧美一区视频在线观看 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产成年人精品一区二区| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产亚洲最大av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 春色校园在线视频观看| a级毛色黄片| 日日啪夜夜爽| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品国产露脸久久av麻豆 | 偷拍熟女少妇极品色| 天天躁日日操中文字幕| 成人性生交大片免费视频hd| 一级av片app| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 人妻一区二区av| 岛国毛片在线播放| 九九在线视频观看精品| 久久热精品热| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美精品国产亚洲| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲四区av| 一级av片app| 天堂网av新在线| 伦精品一区二区三区| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日本爱情动作片www.在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 国产69精品久久久久777片| 高清在线视频一区二区三区| 成人欧美大片| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 天堂中文最新版在线下载 | 国产精品一区二区性色av| 街头女战士在线观看网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美成人午夜免费资源| 赤兔流量卡办理| 女人久久www免费人成看片| 久久久久久九九精品二区国产| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲内射少妇av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 99热这里只有精品一区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲精品aⅴ在线观看| 少妇丰满av| 精品一区在线观看国产| 一本久久精品| 国产单亲对白刺激| 成人一区二区视频在线观看| 一个人看的www免费观看视频| freevideosex欧美| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 中国美白少妇内射xxxbb| 三级国产精品欧美在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 91久久精品国产一区二区三区| 97热精品久久久久久| 婷婷色av中文字幕| 成人欧美大片| 最近中文字幕2019免费版| 国产黄频视频在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 欧美zozozo另类| 久久久久网色| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久久九九精品影院| 国产单亲对白刺激| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲精品,欧美精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品成人av观看孕妇| av在线老鸭窝| 免费无遮挡裸体视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品自拍成人| 亚洲乱码一区二区免费版| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日韩强制内射视频| 久久国内精品自在自线图片| av线在线观看网站| 精品少妇黑人巨大在线播放| 在线观看av片永久免费下载| www.色视频.com| 一区二区三区四区激情视频| 国产中年淑女户外野战色| 直男gayav资源| 日本熟妇午夜| 久久99蜜桃精品久久| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲av一区综合| 午夜爱爱视频在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美日本视频| 男的添女的下面高潮视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 三级毛片av免费| 中文在线观看免费www的网站| 国产成人一区二区在线| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲伊人久久精品综合| 久久6这里有精品| 又爽又黄a免费视频| 久久热精品热| 国产精品久久久久久av不卡| 国产成人a区在线观看| 亚洲精品视频女| 搡老妇女老女人老熟妇| 又爽又黄a免费视频| 午夜福利高清视频| 亚洲高清免费不卡视频| 免费av观看视频| 免费看a级黄色片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产成人精品一,二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 欧美+日韩+精品| www.色视频.com| 水蜜桃什么品种好| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲av一区综合| 中文在线观看免费www的网站| 久久精品人妻少妇| 好男人视频免费观看在线| 99久久精品一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品一区www在线观看| 亚洲在久久综合| 七月丁香在线播放| 国产精品伦人一区二区| 在线a可以看的网站| 日韩精品有码人妻一区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 男人舔奶头视频| 中文天堂在线官网| 国产不卡一卡二| 成人国产麻豆网| 一级毛片电影观看| 国产片特级美女逼逼视频| 老女人水多毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 亚洲精品乱久久久久久| 在线观看免费高清a一片| 亚洲av不卡在线观看| 色5月婷婷丁香| 精品人妻视频免费看| 国产av不卡久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产在线一区二区三区精| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 亚洲av福利一区| 春色校园在线视频观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | av免费在线看不卡| 天天躁日日操中文字幕| 99久久人妻综合| 亚洲经典国产精华液单| 草草在线视频免费看| 日韩av在线大香蕉| 精品久久久久久成人av| 女人久久www免费人成看片| 精品一区二区免费观看| 男女视频在线观看网站免费| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲高清免费不卡视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一夜夜www| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本熟妇午夜| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美 日韩 精品 国产| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美日韩精品成人综合77777| 最近中文字幕高清免费大全6| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 久久99蜜桃精品久久| 偷拍熟女少妇极品色| 乱系列少妇在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产av不卡久久| 三级毛片av免费| 18+在线观看网站| 久久99精品国语久久久| 欧美一区二区亚洲| 国产精品伦人一区二区| 99久久九九国产精品国产免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 观看美女的网站| 干丝袜人妻中文字幕| 尾随美女入室| 亚洲自拍偷在线| 免费观看性生交大片5| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 激情 狠狠 欧美| a级毛色黄片| 天堂中文最新版在线下载 | 日本一二三区视频观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 丝瓜视频免费看黄片| av在线蜜桃| 精品久久国产蜜桃| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日本与韩国留学比较| 一二三四中文在线观看免费高清| 天堂影院成人在线观看| 岛国毛片在线播放| www.色视频.com| 国产精品熟女久久久久浪| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 极品教师在线视频| 亚洲成色77777| 久久久久久久久久黄片| 久99久视频精品免费| 在线播放无遮挡| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久韩国三级中文字幕| videos熟女内射| 91久久精品电影网| 舔av片在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产高清不卡午夜福利| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色5月婷婷丁香| 成人国产麻豆网| 毛片女人毛片| 中文字幕av在线有码专区| 日本午夜av视频| 一区二区三区免费毛片| 国产免费又黄又爽又色| 婷婷色麻豆天堂久久| 成人午夜高清在线视频| 国产 一区 欧美 日韩| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲av一区综合| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产成人精品久久久久久| 男女国产视频网站| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲精品一二三| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产色爽女视频免费观看| 在线观看av片永久免费下载| 免费观看性生交大片5| 国产色爽女视频免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 日本av手机在线免费观看| 伊人久久国产一区二区| 国产高潮美女av| 日本av手机在线免费观看| av黄色大香蕉| 日韩人妻高清精品专区| 日本爱情动作片www.在线观看| 天堂影院成人在线观看| 久久热精品热| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲人成网站高清观看| 国产极品天堂在线| 大片免费播放器 马上看| 国产探花在线观看一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| videossex国产| 国产激情偷乱视频一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲无线观看免费| 亚洲av.av天堂| 国产精品一二三区在线看| 亚洲av二区三区四区| 色哟哟·www| 亚洲美女搞黄在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 午夜亚洲福利在线播放| 国产在视频线在精品| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲av成人精品一区久久| 只有这里有精品99| 嫩草影院入口| a级一级毛片免费在线观看| 久久精品国产自在天天线| 男人和女人高潮做爰伦理| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产 亚洲一区二区三区 | 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲性久久影院| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久精品久久久久久久性| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久精品94久久精品| 亚洲不卡免费看| 亚洲av中文av极速乱| 91精品伊人久久大香线蕉| 联通29元200g的流量卡| 亚洲最大成人手机在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产 亚洲一区二区三区 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 99久久九九国产精品国产免费| 床上黄色一级片| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲av日韩在线播放| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产色婷婷99| 哪个播放器可以免费观看大片| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲美女视频黄频| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品.久久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 免费黄频网站在线观看国产| 人人妻人人澡欧美一区二区| 高清欧美精品videossex| 日本熟妇午夜| 精品久久久久久久久av| 中文字幕免费在线视频6| 精品人妻偷拍中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 日本wwww免费看| 午夜激情福利司机影院| 最近中文字幕2019免费版| 欧美一区二区亚洲| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲最大成人中文| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美成人午夜免费资源| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲综合精品二区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产成人福利小说| 亚洲精品一区蜜桃| 欧美日韩在线观看h| 久久久久网色| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 99久久精品热视频| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本av手机在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日日撸夜夜添| 国产精品伦人一区二区| av网站免费在线观看视频 | 夜夜爽夜夜爽视频| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲一区高清亚洲精品| a级毛色黄片| 欧美最新免费一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 久久这里有精品视频免费| xxx大片免费视频| 日本黄色片子视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费观看精品视频网站| xxx大片免费视频| 欧美成人午夜免费资源| 在线观看一区二区三区| 色视频www国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99久久精品国产国产毛片| 欧美高清成人免费视频www| 一级a做视频免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品.久久久| 乱人视频在线观看| 免费看不卡的av| 热99在线观看视频| 亚洲人成网站在线播| 亚洲av成人精品一二三区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 美女大奶头视频| 少妇熟女欧美另类| 国产爱豆传媒在线观看| 99久国产av精品国产电影| 免费大片黄手机在线观看| 久久久精品94久久精品| 青春草视频在线免费观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产极品天堂在线| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日韩国内少妇激情av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲成人精品中文字幕电影| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久精品免费免费高清| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 女人久久www免费人成看片| 欧美zozozo另类| 免费看光身美女| 18禁在线播放成人免费| 99re6热这里在线精品视频| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲色图av天堂| 免费观看性生交大片5| 久久久久国产网址| 国产亚洲精品久久久com| 午夜日本视频在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲国产欧美在线一区| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久6这里有精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲精品日韩av片在线观看| 男女那种视频在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 97热精品久久久久久| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品伦人一区二区| 亚洲av男天堂| 18+在线观看网站| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品熟女少妇av免费看| 国产麻豆成人av免费视频| 只有这里有精品99| 日日啪夜夜爽| 亚洲精品国产成人久久av| 国产精品.久久久| 禁无遮挡网站| 2022亚洲国产成人精品| 久久精品国产亚洲av天美| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 色播亚洲综合网| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 午夜福利高清视频| 国产91av在线免费观看| 精品久久国产蜜桃| 国产精品.久久久| 久久久久精品性色| 久久精品国产自在天天线| 国产色婷婷99| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 天堂中文最新版在线下载 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产欧美日韩精品一区二区| 69av精品久久久久久| 欧美xxⅹ黑人| 女人被狂操c到高潮| 美女黄网站色视频| 伦精品一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久韩国三级中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美另类一区| 亚洲成色77777| 最近的中文字幕免费完整| 国产一区二区三区av在线| 日本一本二区三区精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品456在线播放app| av又黄又爽大尺度在线免费看| 搞女人的毛片| 五月天丁香电影| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩视频在线欧美| 欧美zozozo另类| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美精品国产亚洲| 免费看光身美女| 男人爽女人下面视频在线观看| av国产免费在线观看| 精品久久久噜噜| 一区二区三区四区激情视频| 男的添女的下面高潮视频| 九九爱精品视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| av福利片在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人免费观看mmmm| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩欧美精品v在线| 国产成人精品一,二区| av在线播放精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久这里只有精品中国| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 午夜激情欧美在线| 国产三级在线视频| 亚洲精品456在线播放app| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产黄色免费在线视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美bdsm另类| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久综合国产亚洲精品| 成年版毛片免费区| 久久久久九九精品影院| 久久久久久九九精品二区国产| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 成人特级av手机在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 一二三四中文在线观看免费高清| 成人亚洲欧美一区二区av| 五月天丁香电影| 国产av在哪里看| 亚洲精品国产av蜜桃| 七月丁香在线播放| 中文资源天堂在线| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩精品有码人妻一区| 欧美日本视频| 久久久久网色| 久久久成人免费电影| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国内精品宾馆在线| 精品国产三级普通话版| 久久久久免费精品人妻一区二区| 老司机影院成人| 亚洲国产av新网站| 欧美人与善性xxx| 能在线免费观看的黄片| 亚洲av.av天堂| 国产成人freesex在线| 水蜜桃什么品种好| 久久久成人免费电影| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产片特级美女逼逼视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲性久久影院| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 岛国毛片在线播放| 国产乱来视频区| 国产亚洲91精品色在线| av天堂中文字幕网| 国产v大片淫在线免费观看| 综合色av麻豆| 亚洲欧美一区二区三区黑人 |