• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    單寧酸通過選擇性抑制表皮生長因子受體特定位點(diǎn)磷酸化抑制腫瘤細(xì)胞的增殖

    2018-03-20 03:30:02阮海華胡雙艷張春晨
    食品科學(xué) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:單寧酸酪氨酸膠質(zhì)瘤

    阮海華,胡雙艷,張春晨,余 龍,張 真

    (天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134)

    表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物,是EGFR Her家族成員之一,該家族包括EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)[1]。表皮生長因子是一個分子質(zhì)量約為170 kDa的跨膜糖蛋白受體,具有酪氨酸激酶活性。在表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)或者轉(zhuǎn)化生長因子α(transforming growth factor α,TGFα)等的激活下,受體發(fā)生二聚化,從而改變了受體的構(gòu)象,激活酪氨酸激酶活性,催化EGFR的磷酸化激活[2]。EGFR廣泛分布在許多正常和惡性上皮細(xì)胞中,其過度表達(dá)和自我激活可能與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[3]。研究表明,頭頸部腫瘤[4]、乳腺癌[5]、陰莖鱗狀細(xì)胞癌[6]以及肺癌[7]等均被發(fā)現(xiàn)EGFR的高水平表達(dá)。與EGFR蛋白的高表達(dá)相比,EGFR的過度磷酸化激活也是導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變的關(guān)鍵因素之一?;诖?,目前針對EGFR的抗癌藥物研發(fā)主要從2 個方面出發(fā):一方面是專一性識別EGFR的單克隆抗體,這類抗體能夠與EGFR專一性結(jié)合,封閉EGFR的胞外配體識別表位,競爭性地抑制EGF等配體與EGFR結(jié)合以及由此導(dǎo)致的磷酸化激活[8];另一方面是EGFR酪氨酸激酶抑制劑,其通過抑制酪氨酸激酶活性抑制EGFR的磷酸化,進(jìn)而調(diào)控受EGFR磷酸化控制的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,抑制癌細(xì)胞的增殖[9]。

    單寧酸(tannic acid,TA),又稱中國單寧、鞣酸、五棓子單寧酸,化學(xué)式為C76H52O46,結(jié)構(gòu)如圖1所示。一般認(rèn)為其結(jié)構(gòu)是由葡萄糖的5 個羥基和沒食子酰基結(jié)合而成的酯,屬于水解類單寧,可水解為葡萄糖和沒食子酸。單寧酸屬于易溶于水的植物多酚類化合物,在紅葡萄酒、茶葉、水果中均含量較多,具有抗突變[10]、抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、抗菌[13]等生物學(xué)活性。近年來,除了自由基清除和抗氧化功能,單寧酸在抗腫瘤方面的功能愈加獲得人們的關(guān)注[14]。然而,基于單寧酸的結(jié)構(gòu),其難以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,迄今為止,單寧酸實(shí)現(xiàn)跨膜信號傳遞的分子機(jī)制仍不清楚。最新的研究發(fā)現(xiàn),單寧酸能夠作用于乳腺癌細(xì)胞EGFR,誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。已知EGFR的過表達(dá)和過度激活是調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的重要因素。例如,接近40%~50%的膠質(zhì)瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)EGFR的表達(dá)增加和過度激活[16]。因此,本研究以人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為研究對象,探究單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控作用,為深入挖掘單寧酸抗腫瘤的藥理作用,闡述食品中單寧酸的抗癌功效提供理論依據(jù)。

    圖1 單寧酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of tannic acid

    1 材料與方法

    1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

    單寧酸(CAS號1401-55-4,相對分子質(zhì)量為1 701.20) 美國Sigma-Aldrich公司;人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞由東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院Inoue教授提供;Gibco胎牛血清 美國Thermo Fisher公司;HyClone? DMEM高糖培養(yǎng)基 美國GE Healthcare公司;EGF 北京義翹神州生物技術(shù)有限公司;PathScan?磷酸化EGFR panTyr三明治酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、磷酸化EGFR(Tyr845)抗體、磷酸化EGFR(Tyr1068)抗體、磷酸化EGFR(Tyr1045)抗體、磷酸化EGFR(Tyr992)抗體、EGFR抗體、磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK)抗體、ERK抗體、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator transcription,STAT)1 pY705抗體、STAT3抗體、STAT1抗體 美國Cell Signaling Technology公司;微管蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關(guān)X(Bcl-2 associated X,Bax)蛋白、線粒體電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)蛋白、細(xì)胞色素c(cytochrome c,Cyt c)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)偶聯(lián)二抗 美國Santa Cruz Technology公司;電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒 威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司;G3850 3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,MTS)細(xì)胞增殖試劑盒 美國Promega公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    細(xì)胞培養(yǎng)皿等細(xì)胞培養(yǎng)耗材 美國Corning公司;HERACELL 150iCO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司;SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國Molecular Device公司;Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)印槽、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國Bio-Rad公司;AlphaImager Mini凝膠成像系統(tǒng) 美國Protein Simple公司;5430R小型臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Eppendorf公司。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中,并置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以0.25 g/100 mL胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)單層細(xì)胞融合度達(dá)到70%~80%時(shí)進(jìn)行單寧酸處理。處理培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基內(nèi)含相應(yīng)濃度單寧酸(40、80、120 μmol/L),每組3 個復(fù)孔,培養(yǎng)24、48、72 h后,用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,并收集至離心管中。

    1.3.2 人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖能力的測定

    人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞以6×104個/mL的濃度接種于96 孔板內(nèi),每孔100 μL培養(yǎng)基。24 h后吸棄培養(yǎng)基,分別加入100 μL含不同濃度單寧酸(40、80、120 μmol/L)的完全培養(yǎng)基,每組3 個復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、48、72 h。采用MTS細(xì)胞增殖試劑盒根據(jù)OD490nm測定細(xì)胞增殖能力,細(xì)胞存活率按下式計(jì)算。

    1.3.3 人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR酪氨酸位點(diǎn)磷酸化水平的測定

    獲取引發(fā)式語料的方法主要有口頭報(bào)告、角色扮演、話語補(bǔ)全任務(wù)、多項(xiàng)選擇任務(wù)、分級任務(wù)、訪談和日記等。下面逐一介紹這些方法,重在講明它們各自的適用范圍和所針對的目標(biāo)語料,因?yàn)橹挥忻鞔_了每種方法能做什么和不能做什么,善做什么和不善做什么,才能根據(jù)具體研究問題選擇具體研究工具,才能發(fā)揮每種工具的最大效用,做到對癥下藥,有的放矢。

    將單寧酸處理后的細(xì)胞按照PathScan?磷酸化EGFR(panTyr)三明治ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行總酪氨酸磷酸化水平的檢測。

    1.3.4 亞細(xì)胞組分(線粒體、細(xì)胞胞漿)的分離

    經(jīng)單寧酸處理后人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的亞細(xì)胞組分的分離參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

    1.3.5 蛋白質(zhì)印記法

    檢測人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR Y884、Y992、Y1068以及Y1172位點(diǎn)的磷酸化水平,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2以及Cyt c等均采用蛋白質(zhì)印記法。細(xì)胞處理方法同1.3.1節(jié),收集細(xì)胞,參照文獻(xiàn)[18]的方法制備蛋白,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)后轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂乳粉封閉。將一抗按照體積比1∶1 000稀釋后于4 ℃孵育過夜。以TBST(tris buffered saline with Tween)溶液洗滌3 次后加入體積比1∶2 000稀釋的二抗,室溫孵育1 h。采用ECL試劑顯影曝光后洗X光片,利用Alpha Imager Mini凝膠成像系統(tǒng)測定條帶的灰度值,利用灰度值表征條帶的強(qiáng)度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS V18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,同時(shí)通過the Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3 次,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖活性的影響

    圖2 單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of tannic acid on the proliferation of human glioma U87 cells

    通過MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果如圖2所示。與未處理的對照組細(xì)胞相比,40 μmol/L的單寧酸處理24 h后,顯著誘導(dǎo)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的死亡(P<0.05),并且細(xì)胞死亡的比率隨著單寧酸處理時(shí)間的延長(48~72 h)以及單寧酸濃度的升高(80~120 μmol/L)而升高,呈現(xiàn)顯著的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。即單寧酸的濃度越高、處理時(shí)間越長,人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的死亡率越高,這與Darvin等[15]發(fā)現(xiàn)單寧酸能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的結(jié)果類似。結(jié)果表明,單寧酸能夠抑制人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,抗腫瘤效果顯著。

    圖3 單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白的影響Fig.3 Effect of tannic acid on apoptosis-related proteins in human glioma U87

    由圖3可知,與對照組相比,80 μmol/L單寧酸處理顯著促進(jìn)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá),抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步對2 種蛋白的條帶灰度進(jìn)行掃描后計(jì)算Bax/Bcl-2的比值,結(jié)果如圖4所示。

    80 μmol/L單寧酸處理24~72 h后,提高了Bax/Bcl-2的比值,與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。單寧酸處理48 h,Bax/Bcl-2比值被提高接近至7.3 倍。Bax/Bcl-2比值是表征細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)之一,當(dāng)Bax/Bcl-2比值升高時(shí),暗示細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。同時(shí),進(jìn)一步分離細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞胞漿2 個組分發(fā)現(xiàn),單寧酸處理提高了線粒體Bax蛋白的水平,同時(shí)促進(jìn)了Cyt c向細(xì)胞胞漿中分泌[20]。因此推測,單寧酸抑制人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖可能與單寧酸處理誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。

    圖4 單寧酸處理對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞總Bax/Bcl-2比值的影響Fig.4 Effect of tannic acid on Bax/Bcl-2 ratio in human glioma U87 cells

    2.2 單寧酸選擇性抑制人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR特定位點(diǎn)的磷酸化

    與EGFR蛋白的高表達(dá)相比,EGFR的磷酸化激活是導(dǎo)致細(xì)胞癌變、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的重要因素[21]。為了研究單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR磷酸化的調(diào)控作用,本研究利用通路掃描磷酸化EGFR三明治ELISA試劑盒檢測了EGFR總磷酸化水平,結(jié)果如圖5所示。

    圖5 單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR總磷酸化水平的影響Fig.5 Effect of tannic acid on the whole phosphorylation of EGFR in human glioma U87 cells

    80 μmol/L單寧酸處理24 h后極顯著降低了經(jīng)表皮生長因子誘導(dǎo)的EGFR磷酸化水平,并且隨著處理時(shí)間的延長,單寧酸對EGFR磷酸化的抑制程度更加顯著。結(jié)果表明,單寧酸抑制人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR總酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平。

    圖6 單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR特定位點(diǎn)磷酸化的影響Fig.6 Site-specif i c effect of tannic acid on EGFR phosphorylation in human glioma U87 cells

    鑒于EGFR不同位點(diǎn)的磷酸化與不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相偶聯(lián),因此,為了進(jìn)一步深入研究單寧酸的抗腫瘤功能,實(shí)驗(yàn)篩選出EGFR的Y845、Y992、Y1068和Y1045這4 個具有代表性的位點(diǎn),并檢測了單寧酸對EGFR單一位點(diǎn)磷酸化的影響。

    圖7 Western-Blot灰度掃描定量分析單寧酸對EGFR特定位點(diǎn)磷酸化的影響Fig.7 Quantitative analysis of tannic acid on site-specif i c phosphorylation of EGFR in human glioma U87 cells by western blot

    由圖6~7可知,單寧酸處理顯著抑制了EGFR Y1045以及Y1068位點(diǎn)的磷酸化,但是對EGFR Y845以及Y992位點(diǎn)的磷酸化影響不大。結(jié)果表明,單寧酸抑制人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR的磷酸化具有位點(diǎn)選擇性。

    2.3 單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞ERK和STAT1/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響

    已有研究表明,EGFR不同位點(diǎn)的磷酸化與不同的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相偶聯(lián),例如EGFR Y1045位點(diǎn)的磷酸化介導(dǎo)STAT1/3的磷酸化,進(jìn)而激活受STAT1/3調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[22];EGFR/ERK信號通路是控制細(xì)胞增殖的重要途徑,其過量表達(dá)與激活易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9]。而EGFR Y1068位點(diǎn)的磷酸化能夠招募生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,Grb2)蛋白,激活MAPK/ERK的磷酸化[23]。因此,為了進(jìn)一步驗(yàn)證單寧酸對EGFR特定位點(diǎn)的磷酸化調(diào)節(jié)作用,實(shí)驗(yàn)利用單寧酸處理人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,檢測STAT1/3以及ERK的磷酸化激活情況。

    圖8 單寧酸對人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞ERK以及STAT1/3磷酸化的影響Fig.8 Effect of tannic acid on the phosphorylation of ERK and STAT1/3 in human glioma U87 cells

    由圖8可知,單寧酸顯著抑制了ERK、STAT1以及STAT3的磷酸化,這與單寧酸抑制EGFR Y1068和Y1045的磷酸化結(jié)果一致。結(jié)果表明,單寧酸通過抑制EGFR特異位點(diǎn)的磷酸化進(jìn)而抑制了由該位點(diǎn)介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化。

    3 討 論

    植物多酚的抗腫瘤活性己被廣泛認(rèn)可,大量研究證實(shí),許多植物多酚(如白藜蘆醇、姜黃素、原花青素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素等)[24]可以通過干擾或阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)分子的表達(dá),從而加速腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖,達(dá)到抗腫瘤的作用。植物單寧酸也能夠通過多種信號通路發(fā)揮其抗腫瘤作用[25]。然而,單寧類物質(zhì)如何實(shí)現(xiàn)跨膜的信號傳遞一直不清楚。雖然,Darvin等[15]的研究表明,單寧酸可能通過調(diào)控EGFR的磷酸化發(fā)揮其抗腫瘤作用。但是,目前已經(jīng)報(bào)道的EGFR發(fā)生磷酸化激活的位點(diǎn)有多個,主要包括Y845、Y992、Y1045、Y1068、Y1148、Y1173以及Y1086等,且每一個酪氨酸位點(diǎn)的生物學(xué)功能均不同[26]。本研究發(fā)現(xiàn),單寧酸顯著抑制了由EGF誘導(dǎo)的EGFR全位點(diǎn)的磷酸化水平,但是該抑制作用具有明顯的選擇性,單寧酸能夠選擇性抑制EGFR Y1045和Y1068位點(diǎn)的磷酸化,而對Y845和Y992的影響不大。

    EGFR蛋白主要包括3 個結(jié)構(gòu)域:從NH2端至第621位氨基酸殘基的胞外區(qū)、從621位至644位氨基酸殘基的跨膜結(jié)構(gòu)域以及從644至C末端共計(jì)542 個氨基酸殘基的胞內(nèi)區(qū)。TGFα與EGFR結(jié)合后,即EGFR主要以背靠背的方式發(fā)生二聚化(圖9a、b中A和B),而配體TGFα結(jié)合于二聚體的外側(cè)(圖9a、b中C和D)[27],二聚化的EGFR在其C末端胞內(nèi)區(qū)發(fā)生磷酸化激活,調(diào)控下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Darvin等[15]利用Autodock vina分子模擬軟件,將EGFR胞外區(qū)與單寧酸進(jìn)行分子對接,結(jié)果如圖10所示,單寧酸能夠與EGFR胞外區(qū)結(jié)合,并預(yù)測單寧酸的結(jié)合位點(diǎn)為EGFR上ATP結(jié)合位點(diǎn)。

    圖9 EGFR胞外區(qū)與TGFα結(jié)合后形成二聚體的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)圖(a)和分子互作示意圖(b)[27]Fig.9 Crystal structure of dimerized human EGFR extracellular domain when binding to TGFα ligand (a) and diagram of EGFR and TGFα interaction (b)[27]

    圖10 單寧酸與EGFR胞外區(qū)結(jié)合結(jié)構(gòu)圖[15]Fig.10 Schematic of tannic acid binding to EGFR extracellular domain[15]

    據(jù)此,推測單寧酸抑制EGFR的磷酸化可能有兩個方面的原因:一方面,單寧酸競爭性地與EGFR結(jié)合改變EGFR的構(gòu)象,單寧酸屬于多酚類物質(zhì),多酚可通過疏水鍵向蛋白質(zhì)分子表面靠近,多酚分子進(jìn)入疏水袋,然后發(fā)生多點(diǎn)氫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合,促使蛋白質(zhì)被凝固[14],改變其在細(xì)胞膜上的流動性,進(jìn)而抑制了EGFR的生物學(xué)活性,例如EGFR胞內(nèi)區(qū)的磷酸化,這解釋了單寧酸對EGFR總磷酸化水平的抑制作用;另一方面,通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),與圖10預(yù)測的單寧酸與EGFR相互作用類似,治療小細(xì)胞肺癌的藥物吉非替尼[28]和厄洛替尼[29]也是通過與ATP競爭結(jié)合EGFR酪氨酸激酶區(qū),阻止EGFR的自磷酸化,從而抑制受EGFR調(diào)控的信號通路,最終達(dá)到抑制腫瘤增殖的作用。據(jù)此推測,單寧酸對STAT1/3信號通路的抑制作用可能是由于單寧酸與EGFR結(jié)合后,抑制了EGFR的自磷酸化,而該自磷酸化的抑制會導(dǎo)致Janus酪氨酸激酶(Janus tyrosine kinase,Jak)2活性受到抑制,而Jak2是負(fù)責(zé)STAT蛋白磷酸化的主要蛋白激酶之一[10]。而單寧酸對MAPK/ERK信號通路的抑制作用可能是由于單寧酸抑制了EGFR Y1068的磷酸化,導(dǎo)致Y1068位點(diǎn)專一性Grb2蛋白至EGFR的招募受到抑制,與EGFR-Grb2結(jié)合ERK蛋白減少,ERK的磷酸化受到抑制。當(dāng)利用外源單寧酸處理細(xì)胞時(shí),單寧酸直接作用于EGFR的胞外區(qū)。因此,單寧酸與EGFR胞外區(qū)結(jié)合后有很大的可能性會引起EGFR特定構(gòu)象變化,該構(gòu)象的變化引起EGFR部分酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生旋轉(zhuǎn)扭曲,進(jìn)而導(dǎo)致該位點(diǎn)的磷酸化受到抑制。而受單寧酸調(diào)控的EGFR的構(gòu)象變化還需要進(jìn)一步深入研究。

    除了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖外,單寧酸已經(jīng)被用于很多疾病的治療中。例如Mori等[30]利用30 mg/kg(以體質(zhì)量計(jì),下同)的TA能夠阻止阿茲海默癥引起的細(xì)胞損傷;40 mg/kg的TA對抗癌藥物順鉑引起的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用[31];25 mg/kg的TA對對乙酰氨基酚(acetaminophen)引起的大鼠肝細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用[32]。而本研究中,40 μmol/L單寧酸(相當(dāng)于68 μg/mL血藥濃度)即對細(xì)胞增殖起到顯著的抑制作用,進(jìn)一步表明單寧酸在抑制腫瘤細(xì)胞增殖中應(yīng)用的可行性,為挖掘植物多酚的抗腫瘤功能,開發(fā)植物多酚類抗腫瘤保健食品或藥物提供理論基礎(chǔ)。

    [1] RYU J W, CHOE S, RYU S H, et al. Paradoxical induction of growth arrest and apoptosis by EGF via the up-regulation of PTEN by activating Redox factor-1/Egr-1 in human lung cancer cells[J].Oncotarget, 2016, 8(3): 4181-4195. DOI:10.18632/oncotarget.13809.

    [2] WONG A J, RUPPERT J M, BIGNER S H, et al. Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(7): 2965-2969.

    [3] HANAHAN D, WEINBERG R A. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5): 646-674. DOI:10.4161/rna.20481.

    [4] LEEMANS C R, BRAAKHUIS B J, BRAKENHOFF R H. The molecular biology of head and neck cancer[J]. Nature Reviews Cancer,2011, 11(1): 9-22. DOI:10.1038/nrc2982.

    [5] DAI H, GALLAGHER D, SCHMITT S, et al. Role of miR-139 as a surrogate marker for tumor aggression in breast cancer[J]. Human Pathology, 2017, 61: 68-77. DOI:10.1016/j.humpath.2016.11.001.

    [6] PETA E, CAPPELLESSO R, MASI G, et al. Down-regulation of microRNA-146a is associated with high-risk human papillomavirus infection and epidermal growth factor receptor overexpression in penile squamous cell carcinoma[J]. Human Pathology, 2016, 61: 33-40. DOI:10.1016/j.humpath.2016.10.019.

    [7] XU C R, ZHONG W Z, ZHOU Q, et al. Heterogeneity of the resistance to gef i tinib treatment in a non-small cell lung cancer patient with active epidermal growth factor receptor mutation[J]. Thoracic Cancer, 2016, 8(1): 51-53. DOI:10.1111/1759-7714.12382.

    [8] GUEERRAB A E I, BAMDAD M, BIGNON Y J, et al. Anti-EGFR monoclonal antibodies enhance sensitivity to DNA-damaging agents in BRCA1-mutated and PTEN-wild-type triple-negative breast cancer cells[J]. Molecular Carcinogenesis, 2016, 56(5): 1383-1394.DOI:10.1002/mc.22596.

    [9] CHENG L, ZHANG S, ALEXANDER R, et al. The landscape of EGFR pathways and personalized management of non-small-cell lung cancer[J]. Future Oncology, 2011, 7(4): 519-541. DOI:10.2217/fon.11.25.

    [10] PARK J H, DARVIN P, LIM E J, et al. Hwanggeumchal sorghum induces cell cycle arrest, and suppresses tumor growth and metastasis through Jak2/STAT pathways in breast cancer xenografts[J]. PLoS ONE, 2012, 7(7): 1-13. DOI:10.1371/journal.pone.0040531.

    [11] TOMAS-BARBERAN F A, SELMA M V, ESPíN J C, et al.Interactions of gut microbiota with dietary polyphenols and consequences to human health[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 2016, 19(6): 471-476. DOI:10.1097/MCO.0000000000000314.

    [12] TATULLO M, SIMONE G M, TARULLO F, et al. Antioxidant and antitumor activity of a bioactive polyphenolic fraction isolated from the brewing process[J]. Scientif i c Reports, 2016, 6: 1-7. DOI:10.1038/srep36042.

    [13] TALEB H, MADDOCKS S E, MORRIS R K, et al. The Antibacterial activity of date syrup polyphenols against S. aureus and E. coli[J].Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 1-9. DOI:10.1038/srep36042.

    [14] SHIN S Y, YOON H, AHN S, et al. Structural properties of polyphenols causing cell cycle arrest at G1 phase in HCT116 human colorectal cancer cell lines[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(8): 16970-16985. DOI:10.3390/ijms140816970.

    [15] DARVIN P, JOUNG Y H, KANG D Y, et al. Tannic acid inhibits EGFR/STAT1/3 and enhances p38/STAT1 signalling axis in breast cancer cells[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2017,21(4): 720-734. DOI:10.1111/jcmm.13015.

    [16] NISHIKAWA R, JI X D, HARMON R C, et al. A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91(16): 7727-7731.

    [17] WEST A P, BRODSKY I E, RAHNER C, et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS[J]. Nature, 2011, 472: 476-480. DOI:10.1038/nature09973.

    [18] RUAN H H, ZHANG Z, TIAN L, et al. The Salmonella effector SopB prevents ROS-induced apoptosis of epithelial cells by retarding TRAF6 recruitment to mitochondria[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 478(2): 618-623. DOI:10.1016/j.bbrc.2016.07.116.

    [19] UM H D. Bcl-2 family proteins as regulators of cancer cell invasion and metastasis: a review focusing on mitochondrial respiration and reactive oxygen species[J]. Oncotarget, 2016, 7(5): 5193-5203.DOI:10.18632/oncotarget.6405.

    [20] BURRI S H, KIM C N, FANG G, et al. ‘Loop’ domain deletional mutant of Bcl-xL is as effective as p29Bcl-xL in inhibiting radiationinduced cytosolic accumulation of cytochrome c (cyt c), caspase-3 activity, and apoptosis[J]. International Journal of Radiation Oncology,Biology, Physics, 1999, 43(2): 423-430.

    [21] TANG N, ZHANG Q Q, FANG S, et al. Anti-tumor activity of highdose EGFR tyrosine kinase inhibitor and sequential docetaxel in wild type EGFR non-small cell lung cancer cell nude mouse xenografts[J].Oncotarget, 2016, 8(6): 9134-9143. DOI:10.18632/oncotarget.13327. 22.

    [22] ZULKIFLI A A, TAN F H, PUTOCZKI T L, et al. STAT3 signaling mediates tumour resistance to EGFR targeted therapeutics[J].Molecular and Cellular Endocrinology, 2017, 451: 15-23.DOI:10.1016/j.mce.2017.01.010.

    [23] BAUMDICK M, BRGUUEMANN Y, SCHMICK M, et al. EGF-dependent re-routing of vesicular recycling switches spontaneous phosphorylation suppression to EGFR signaling[J]. eLife, 2015, 4:e12223. DOI:10.18632/oncotarget.13809.24.

    [24] 石芳, 廖霞, 李瑤, 等. 植物多酚通過PI3K/Akt信號通路抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(15): 259-264. DOI:10.7506/spk xl002-6630-201615044.201615044.

    [25] 張小利, 王慧清, 張?jiān)虑? 等. 植物多酚通過Wnt/β-catenin信號通路抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(5): 227-232.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201505042.

    [26] MORANDELL S, STASYK T, SKVORTSOV S, et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics reveal novel insights into complexity and dynamics of the EGFR signaling network[J].Proteomics, 2008, 8(21): 4383-4401. DOI:10.1002/pmic.200800204.

    [27] GARRETT T P, MCKERN N M, LOU M, et al. Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha[J]. Cell, 2002, 110(6): 763-773.

    [28] MASSA A, ANTUNES A, VARELA P. Pyogenic granuloma in a patient on gefitinib[J]. Acta Medica Portuguesa, 2016, 29(6): 416.DOI:10.20344/amp.6343.

    [29] ZHAO C H, LIN L, LIU J Z, et al. A phase Ⅱ study of concurrent chemoradiotherapy and erlotinib for inoperable esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7(35): 57310-57316.DOI:10.18632/oncotarget.9809.

    [30] MORI T, REZAI-ZADEH K, KOYAMA N, et al. Tannic acid is a natural beta-secretase inhibitor that prevents cognitive impairment and mitigates Alzheimer-like pathology in transgenic mice[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(9): 6912-6927. DOI:10.1074/jbc.M111.294025.

    [31] AKOMOLAFE S F, AKINYEMI A J, ANADOZIE S O. Phenolic acids (gallic and tannic acids) modulate antioxidant status and cisplatin induced nephrotoxicity in rats[J]. International Scholarly Research Notices, 2014, 2014: 1-8. DOI:10.1155/2014/984709.

    [32] MITTAL D K, JOSHI D, SHUKLA S. Protective effects of Polygonum bistorta (Linn.) and its active principle against acetaminophen induced toxicity in rats[J]. Asian Journal of Biological Sciences, 2010, 1: 951-958. DOI:10.1016/j.toxlet.2011.05.809.

    猜你喜歡
    單寧酸酪氨酸膠質(zhì)瘤
    單寧酸對重金屬離子的吸附研究
    單寧酸在斷奶仔豬上的應(yīng)用研究進(jìn)展
    湖南飼料(2023年2期)2023-06-20 02:39:28
    單寧酸與牛頸靜脈的交聯(lián)機(jī)制研究
    單寧酸協(xié)同順鉑增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4通路的激活水平
    枸骨葉提取物對酪氨酸酶的抑制與抗氧化作用
    薔薇花總黃酮對酪氨酸酶的抑制作用及其動力學(xué)行為
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:19:57
    PVC用酪氨酸鑭的合成、復(fù)配及熱穩(wěn)定性能研究
    中國塑料(2016年7期)2016-04-16 05:25:52
    DCE-MRI在高、低級別腦膠質(zhì)瘤及腦膜瘤中的鑒別診斷
    磁共振成像(2015年8期)2015-12-23 08:53:14
    P21和survivin蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義
    Sox2和Oct4在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及意義
    侵犯人妻中文字幕一二三四区| 大码成人一级视频| 九九在线视频观看精品| 久久久a久久爽久久v久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美变态另类bdsm刘玥| 女人久久www免费人成看片| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品aⅴ在线观看| 少妇的逼水好多| 久久久久久久久久成人| 久久久久国产网址| 内地一区二区视频在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 精品一区二区免费观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 草草在线视频免费看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 高清在线视频一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲av男天堂| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 免费少妇av软件| 最近的中文字幕免费完整| 久久精品久久精品一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲国产看品久久| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品.久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 国产av精品麻豆| 一个人免费看片子| 水蜜桃什么品种好| 精品少妇久久久久久888优播| 男人操女人黄网站| 日本免费在线观看一区| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品人妻久久久久久| 免费看不卡的av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲国产av新网站| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 丰满饥渴人妻一区二区三| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 18禁国产床啪视频网站| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲国产av新网站| 咕卡用的链子| 免费人成在线观看视频色| 满18在线观看网站| 久久影院123| 激情视频va一区二区三区| 久久av网站| 久久99精品国语久久久| 高清不卡的av网站| 新久久久久国产一级毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 黑人高潮一二区| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲成色77777| 精品久久久久久电影网| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 伊人亚洲综合成人网| 午夜久久久在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品免费大片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 尾随美女入室| 久久精品国产自在天天线| 黄色毛片三级朝国网站| 国产日韩欧美在线精品| 欧美日韩成人在线一区二区| 黄片播放在线免费| 欧美成人午夜免费资源| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品三级大全| 黄色 视频免费看| 伦理电影大哥的女人| 日韩不卡一区二区三区视频在线| av电影中文网址| 天天影视国产精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 综合色丁香网| 精品亚洲成a人片在线观看| 日本免费在线观看一区| 成人影院久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲经典国产精华液单| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本黄色日本黄色录像| 一级毛片 在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 考比视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 国精品久久久久久国模美| 久久人人97超碰香蕉20202| 色网站视频免费| 少妇的丰满在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 欧美97在线视频| 久久免费观看电影| 亚洲精品av麻豆狂野| 高清在线视频一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 老女人水多毛片| 国产淫语在线视频| 国产高清国产精品国产三级| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲内射少妇av| 99久国产av精品国产电影| 成年av动漫网址| 十八禁网站网址无遮挡| 1024视频免费在线观看| 亚洲综合色网址| 我要看黄色一级片免费的| 韩国精品一区二区三区 | 欧美精品av麻豆av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 婷婷色av中文字幕| 亚洲第一av免费看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | av卡一久久| 人妻系列 视频| h视频一区二区三区| 永久网站在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 天美传媒精品一区二区| 男人舔女人的私密视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 夜夜爽夜夜爽视频| av在线观看视频网站免费| 亚洲色图综合在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件 | 久久青草综合色| 欧美 日韩 精品 国产| 国产av码专区亚洲av| 男女边吃奶边做爰视频| av黄色大香蕉| 久久久亚洲精品成人影院| 少妇的丰满在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 日本与韩国留学比较| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 成人影院久久| a级毛色黄片| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 成人国产麻豆网| 我的女老师完整版在线观看| 插逼视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 超色免费av| 久久ye,这里只有精品| 午夜免费鲁丝| 欧美成人午夜精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美最新免费一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 综合色丁香网| 亚洲精品456在线播放app| 精品视频人人做人人爽| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品乱久久久久久| 中文字幕免费在线视频6| 欧美xxⅹ黑人| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 五月伊人婷婷丁香| 韩国av在线不卡| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费大片18禁| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 爱豆传媒免费全集在线观看| 飞空精品影院首页| 满18在线观看网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产午夜精品一二区理论片| 黑人高潮一二区| 丝袜在线中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 热re99久久国产66热| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 欧美日韩成人在线一区二区| 女性被躁到高潮视频| 伦精品一区二区三区| 黑人高潮一二区| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久国产网址| 日本色播在线视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 黄色配什么色好看| 18+在线观看网站| 国产探花极品一区二区| www.色视频.com| 99久国产av精品国产电影| 久久久国产欧美日韩av| 全区人妻精品视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 青青草视频在线视频观看| a级毛色黄片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 夫妻午夜视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲国产日韩一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品一区www在线观看| 免费看不卡的av| 欧美精品一区二区免费开放| 日本av手机在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 成人免费观看视频高清| 亚洲伊人久久精品综合| 婷婷色综合www| 免费人成在线观看视频色| 视频在线观看一区二区三区| 黄片播放在线免费| 婷婷成人精品国产| 欧美日本中文国产一区发布| 国产极品天堂在线| 男女国产视频网站| 欧美丝袜亚洲另类| 黄色一级大片看看| 亚洲综合色惰| 曰老女人黄片| 久久久精品免费免费高清| 一区二区三区精品91| 精品第一国产精品| 一级爰片在线观看| 日韩大片免费观看网站| 男人舔女人的私密视频| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品一二三区在线看| 在线看a的网站| av卡一久久| 伦精品一区二区三区| 国产精品免费大片| av在线老鸭窝| 日韩制服骚丝袜av| 久久久久久久国产电影| av免费观看日本| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美变态另类bdsm刘玥| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美 日韩 精品 国产| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久国内精品自在自线图片| 99国产综合亚洲精品| 久久97久久精品| 18禁国产床啪视频网站| 欧美精品av麻豆av| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久久久伊人网av| 飞空精品影院首页| 国产熟女午夜一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 国产精品国产三级专区第一集| 在现免费观看毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品成人在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文天堂在线官网| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 色网站视频免费| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 捣出白浆h1v1| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 黄色视频在线播放观看不卡| 满18在线观看网站| 在线 av 中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 精品亚洲成a人片在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 99热这里只有是精品在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产成人精品福利久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产精品三级大全| 赤兔流量卡办理| 国产男人的电影天堂91| 国产免费又黄又爽又色| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av线在线观看网站| 亚洲国产av新网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 女人精品久久久久毛片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 制服诱惑二区| 国产一级毛片在线| 波多野结衣一区麻豆| 国产亚洲一区二区精品| 欧美精品一区二区免费开放| 成人二区视频| 香蕉国产在线看| 99热这里只有是精品在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 精品一区二区三区视频在线| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲人与动物交配视频| 18在线观看网站| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久久久久久久久久大奶| 免费日韩欧美在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男女边摸边吃奶| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩av不卡免费在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 制服丝袜香蕉在线| 国产片特级美女逼逼视频| 男女免费视频国产| 97人妻天天添夜夜摸| av网站免费在线观看视频| a级毛片黄视频| 亚洲av日韩在线播放| 在现免费观看毛片| 美女大奶头黄色视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美日韩成人在线一区二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产极品天堂在线| 蜜桃国产av成人99| 免费在线观看黄色视频的| 中文字幕制服av| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产一级毛片在线| 五月伊人婷婷丁香| 老熟女久久久| 十分钟在线观看高清视频www| 乱人伦中国视频| av福利片在线| 国产 精品1| 色94色欧美一区二区| xxx大片免费视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久久久久久国产电影| 午夜日本视频在线| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲欧美清纯卡通| 国产成人一区二区在线| 777米奇影视久久| 如何舔出高潮| 最新的欧美精品一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| av线在线观看网站| 人人妻人人澡人人看| 午夜精品国产一区二区电影| 大香蕉久久成人网| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本大道久久a久久精品| 亚洲成色77777| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 69精品国产乱码久久久| 国内精品宾馆在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 在线观看三级黄色| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产一区二区激情短视频 | 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲精品日本国产第一区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99热网站在线观看| 国产一级毛片在线| 午夜日本视频在线| 成年人午夜在线观看视频| 国产男女超爽视频在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 如何舔出高潮| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产色片| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产免费一区二区三区四区乱码| 十八禁网站网址无遮挡| 伦理电影免费视频| 男人添女人高潮全过程视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产亚洲一区二区精品| 日韩一本色道免费dvd| 春色校园在线视频观看| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产午夜精品一二区理论片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 这个男人来自地球电影免费观看 | 免费播放大片免费观看视频在线观看| 另类精品久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 我要看黄色一级片免费的| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品一区二区在线不卡| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品色激情综合| 国产乱人偷精品视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 97人妻天天添夜夜摸| 高清黄色对白视频在线免费看| 日韩免费高清中文字幕av| 女性生殖器流出的白浆| 黄色怎么调成土黄色| 免费在线观看完整版高清| 免费av中文字幕在线| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品一区二区三区视频在线| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 春色校园在线视频观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲精品国产av成人精品| 99视频精品全部免费 在线| 一区二区三区乱码不卡18| 成人免费观看视频高清| 久久精品久久精品一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲人与动物交配视频| 午夜影院在线不卡| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲欧美一区二区三区国产| 黄色一级大片看看| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费在线观看完整版高清| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产爽快片一区二区三区| 美女主播在线视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 视频在线观看一区二区三区| a 毛片基地| 天天操日日干夜夜撸| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产成人精品无人区| 大香蕉97超碰在线| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲精品国产av成人精品| 国产av码专区亚洲av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产av码专区亚洲av| 99久国产av精品国产电影| 高清黄色对白视频在线免费看| 人妻少妇偷人精品九色| a级毛片在线看网站| 久久精品夜色国产| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| av在线观看视频网站免费| 国产av国产精品国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲av国产av综合av卡| 青春草国产在线视频| 欧美日韩视频精品一区| 如何舔出高潮| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品国产三级专区第一集| 性色av一级| 男人操女人黄网站| 99久久人妻综合| 亚洲综合色惰| av线在线观看网站| 国产极品粉嫩免费观看在线| av在线app专区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日本欧美视频一区| 有码 亚洲区| 人妻 亚洲 视频| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 免费人成在线观看视频色| 天堂8中文在线网| av视频免费观看在线观看| 国产亚洲最大av| 两个人免费观看高清视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产高清三级在线| 久久久精品94久久精品| 女人久久www免费人成看片| 熟女人妻精品中文字幕| 成人国产麻豆网| 午夜视频国产福利| 99九九在线精品视频| 亚洲精品自拍成人| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄片播放在线免费| 大话2 男鬼变身卡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产男女内射视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 97精品久久久久久久久久精品| 极品人妻少妇av视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| av电影中文网址| 亚洲美女黄色视频免费看| 97在线人人人人妻| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 丁香六月天网| 在线观看国产h片| 人体艺术视频欧美日本| 一边摸一边做爽爽视频免费| 成人国语在线视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 免费观看a级毛片全部| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看免费高清a一片| 视频在线观看一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 免费观看性生交大片5| 国产成人精品无人区| 成年av动漫网址| 中文字幕最新亚洲高清| 免费观看在线日韩| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美少妇被猛烈插入视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 青春草国产在线视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 黄色一级大片看看| 久久人人爽人人片av| 日韩三级伦理在线观看| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲,欧美,日韩| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲欧洲国产日韩| 免费看不卡的av| 大香蕉97超碰在线| 最新中文字幕久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产亚洲精品久久久com| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 18+在线观看网站| 国内精品宾馆在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 18禁国产床啪视频网站| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日韩成人伦理影院| 在线 av 中文字幕| 国产一区二区在线观看av| 欧美激情国产日韩精品一区| 熟女人妻精品中文字幕| 成人国语在线视频| av有码第一页| 天堂俺去俺来也www色官网| 一级片'在线观看视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 免费看av在线观看网站| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观|