類風濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)外泌體及其治療作用的研究進展

李培霆，李龍

(貴州醫(yī)科大學，貴陽550004)

類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性進展性自身免疫性疾病，以炎性細胞在關(guān)節(jié)處浸潤、滑膜增生、血管翳形成、關(guān)節(jié)軟骨及骨持續(xù)破壞為特征。RA早期關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、發(fā)僵等一系列問題，使患者活動困難，如果得不到及時治療，就會發(fā)展到慢性炎癥失控狀態(tài)。外泌體是源于細胞內(nèi)吞作用的細胞外囊泡(EVs)，內(nèi)含豐富生物信息，其存在于許多甚至是全部真核生物的體液中[1]。外泌體類似于病毒顆粒，可將特定的內(nèi)含物包裹后運輸至靶細胞，進而調(diào)控后者的信號轉(zhuǎn)導通路以及基因表達，從而引起特定的生理功能。外泌體的蛋白組成較復雜,包括源細胞非特異性和特異性兩類蛋白分子。前者包括熱休克蛋白、參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的蛋白、各種代謝酶、細胞溶質(zhì)蛋白和四跨膜蛋白等；后者只存在于某種特殊的細胞，如樹突狀細胞(DC)等[2]。外泌體除含有蛋白，還含有小RNA，如微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(IncRNA)，參與基因的表達調(diào)控，故外泌體內(nèi)部所含的生物學信息有望作為自身免疫性疾病診斷的理想標志物。研究報道，外泌體參與RA的發(fā)病過程，在抗原表達、炎癥、血管生成、細胞信號傳導等方面發(fā)揮重要作用[3]。外泌體預示著細胞的病變，遠早于組織和器官病變，對疾病早期診斷有重要意義，且有望作為藥物傳遞的工具或RA治療的靶點。

1 RA相關(guān)外泌體

不同自身抗體的檢測對RA診斷具有不同程度的敏感性和特異性，但由于受年齡、血脂、基礎(chǔ)疾病等因素影響,需要更多的生物標記物來更有效、更方便地診斷RA。外泌體作為最小的EVs已被認為是微環(huán)境中的通訊途徑。它們在細胞間傳遞蛋白質(zhì)和miRNAs，并具有免疫調(diào)節(jié)特性，在不同的關(guān)節(jié)疾病中已經(jīng)檢測到相關(guān)的外泌體類型，提示外泌體可作為診斷或評估RA活動的潛在生物標志物。

1.1 與RA相關(guān)的外泌體蛋白 研究發(fā)現(xiàn)，RA患者的滑膜液和血清EVs含有與RA相關(guān)的特異蛋白，這些蛋白質(zhì)一半以上以瓜氨酸形式存在，進一步提高了其作為診斷指標的特異性。在RA患者血清中，外泌體淀粉樣蛋白A和淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1蛋白與C反應蛋白之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，提示RA患者外泌體淀粉樣蛋白A和淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1蛋白與疾病活動有關(guān)[4]。外泌體攜帶有瓜氨酸蛋白(如纖維蛋白原和波形蛋白)，作為自身抗原可被RA患者的自身抗體識別后誘導滑液中免疫復合物形成，進而刺激關(guān)節(jié)中性粒細胞產(chǎn)生白三烯，從而加重炎癥。除了瓜氨酸蛋白，還有一種由巨噬細胞通過外泌體分泌的核DNA結(jié)合蛋白，也可作為自身抗原呈遞給B細胞，產(chǎn)生自身抗體，形成免疫復合物參與關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生[5]。最近研究表明，RA患者滑液中CD3+和CD8+T細胞源性EVs、CD41 EVs比骨關(guān)節(jié)炎患者顯著增高，且骨關(guān)節(jié)炎中CD41 EVs無法檢測到[6]。

1.2 與RA相關(guān)的外泌體酶 除了前面提到的蛋白，研究還發(fā)現(xiàn)一些酶類如金屬蛋白酶氨基肽酶N與RA的發(fā)病有關(guān)。它在RA患者的滑液中作為EVs表面可溶性分子，可通過基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1從纖維樣滑膜細胞表面(FLSS)裂解，誘導FLSS的生長和遷移，進一步加重關(guān)節(jié)炎癥[7]。D和B-葡糖醛酸酶存在于RA和骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)間隙的EVs中，其在EVs中的定位表明它可能參與了RA的發(fā)展[8]。EVs還具有不同的黏附分子，促進其與免疫細胞的相互作用，如整合素ανβ3和ανβ5[9]。Rab27蛋白是外泌體分泌過程中必不可少的。研究發(fā)現(xiàn)，敲除Rab27基因的Treg細胞失去分泌外泌體的功能后，無法預防部分自身免疫疾病發(fā)生，最終導致嚴重的系統(tǒng)性炎癥疾病[10]。

1.3 與RA相關(guān)的外泌體核酸 對外泌體miRNA差異的新認識為更早、更準確地檢測RA提供了一種新方法。目前研究最多的miRNA是miR155和miR146a。miR155在FLS中可以抑制腫瘤壞死因子-α、MMP-13的產(chǎn)生[11]。RA患者FLSS中，miR146a表達可被腫瘤壞死因子-α和IL-1β上調(diào)，進而抑制IL-6和IL-8分泌，此外miR124a、miR19a等均具有調(diào)節(jié)滑膜細胞增殖和炎性因子的釋放作用[12]。Kim等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-let7b包含在巨噬細胞或RA成纖維細胞的EVs中，可作為TLR7的內(nèi)源性配體，兩者結(jié)合后可誘導幼稚髓系細胞分化為M1型巨噬細胞，從而釋放促炎癥因子，進一步加重關(guān)節(jié)炎癥。不僅如此，一些可以調(diào)節(jié)信號通路的外泌體RNA也被陸續(xù)揭示。Maeda等[14]通過基因芯片篩選出22個FLS-miRNA的外泌體被證明可以調(diào)節(jié)RA中的骨通路，例如，腫瘤壞死因子(TNF)可上調(diào)RA FLS分泌的外泌miR-211-3p過表達，抑制成骨細胞的分化、鈣化。除了miRNA，近年發(fā)現(xiàn)一種反轉(zhuǎn)錄IncRNA(Hotair)在RA患者血清外泌體中高表達，可誘導活化的巨噬細胞遷移，導致MMP-2和MMP-13水平明顯降低[15]?？梢娡饷隗w中富含的蛋白質(zhì)以及核酸不僅參與了RA的發(fā)病，而且還是RA具有診斷價值的生物標志物。

2 外泌體在RA治療中的作用

眾所周知，抗RA的藥物包括非甾體類抗炎藥、皮質(zhì)類固醇和抗風濕疾病藥物，這些療法都沒能從根本上治療RA。然而藥物的不良作用一直是RA治療的障礙，特別是新的生物制劑。在RA中，利用外泌體能再次誘導機體對自身抗原的耐受，可防止疾病的發(fā)生發(fā)展。

有文獻報道，在RA中檢測到由FLSS釋放的EVS是一種膜型TNF-α的EVS。這些TNF表達陽性的外泌體使活化的T細胞具有抗凋亡的能力，進而引起炎癥反應，這也是T細胞介導RA的發(fā)病機制之一。提示阻斷TNF表達外泌體是治療RA的一種方法。DC衍生外泌體是非常穩(wěn)定而被譽為腫瘤免疫治療的“疫苗”。用帶有FasL基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC能夠抑制膠原誘導的關(guān)節(jié)炎炎癥反應。此外，IL-10誘導的DC來源的外泌體具有較強的抗T細胞活性。當分離、純化后注射到炎癥部位，炎癥可得到減輕，注射的對側(cè)關(guān)節(jié)炎癥反應也得到了改善。還有研究表明，高表達吲哚胺雙氧酶的DC起源的外泌體能夠在一定程度上緩解膠原誘導小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，且免疫抑制作用比DC本身還要強，可能是外泌體可促進Treg細胞的激活與增殖。因此,DC來源的外泌體可能為治療RA的一種新療法。在實驗性關(guān)節(jié)炎模型中，中性粒細胞衍生的EVs已被證明對RA的軟骨合成有促進作用。體外和體內(nèi)實驗表明，中性粒細胞可分泌含有抗炎癥蛋白A(AnxA1)的EVs。促進軟骨細胞產(chǎn)生TGF-β1，關(guān)節(jié)間隙注射含AnxA1的EVs可使炎癥性關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨破壞減少[6]。

最新研究[17]發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體是一種類似外泌體的小人工囊泡，它具有裝載藥物進入細胞的能力。利用這一特性，將APO2L與脂質(zhì)體結(jié)合后注射入動物的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)可大幅減少滑膜增生和炎癥。Vanniasinghe等[18]成功地將糖皮質(zhì)激素以人工囊泡的形式傳遞到滑膜，在膠原誘導關(guān)節(jié)炎模型中觀察到炎癥減輕。通過脂質(zhì)體的輸送，可很大程度上減少類固醇類藥物不良作用。Lamichhane等[19]發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞釋放的EVs是近年發(fā)現(xiàn)的簡化無細胞的組織再生療法，藥物等活性分子可以被填充于骨髓間充質(zhì)干細胞且衍生EVs,比單用骨髓間充質(zhì)干細胞療效增強，為治療自身免疫性疾病的一種潛在替代方法。

免疫復合物在組織中的沉積被認為是RA發(fā)病主要機制之一。補體參與免疫復合物組成，且分布于滑液中EVs表面。事實上，一旦補體級聯(lián)被激活，許多促炎產(chǎn)物就會釋放出來，在膠原誘導關(guān)節(jié)炎模型中，注射抗C5單克隆抗體可抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，提示可能是補體與EVs相互作用導致RA炎癥狀態(tài)。有文獻[20]報道，腫瘤移植到缺乏DNA結(jié)合核轉(zhuǎn)錄因子抑制物1表達的小鼠體內(nèi)未能生長和轉(zhuǎn)移，表明DNA結(jié)合核轉(zhuǎn)錄因子抑制物1參與了血管生成。Edhayan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者的滑膜成纖維細胞中，DNA結(jié)合核轉(zhuǎn)錄因子抑制物1包被在EVs中，且是成纖維細胞分泌的主要成分，激活內(nèi)皮細胞c-Jun氨基末端激酶信號，在體外和體內(nèi)產(chǎn)生促血管形成作用。因此，外泌體DNA結(jié)合核轉(zhuǎn)錄因子抑制物1可能是一種有用的治療方法。除了DC和中性粒細胞衍生的外泌體具有治療作用外，還有口服牛乳源性EVs可減輕膠原誘導型關(guān)節(jié)炎模型炎癥的報道。由此預測，外泌體自身不僅可作為治療藥物，而且可作為結(jié)合藥物的載體，滿足精準治療的需求。

綜上所述，外泌體在RA的治療中顯示出了巨大的優(yōu)勢和潛力。外泌體相比其他在生物體液如血清或尿液中發(fā)現(xiàn)的生物標志物，表現(xiàn)出較高的特異性和穩(wěn)定性。這使得外泌體中的蛋白質(zhì)及IncRNA成為研究熱點。目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品，并且沒有任何一個單一實驗可以確定外泌體的存在。故未來的研究將需要開發(fā)標準化的EV分離和量化技術(shù)。RA血液衍生外泌體對破骨細胞的分化有明顯抑制作用，是人類破骨發(fā)生的新調(diào)節(jié)因子，那外泌體是如何選擇性表達某種信號分子仍需要大量的研究來解釋。當然，外泌體還參與免疫抑制細胞的免疫抑制和活化，調(diào)節(jié)抗原的表達，誘導T細胞凋亡。深入了解兩者之間的聯(lián)系有利于為將來診斷和治療RA提供創(chuàng)新性線索。