PAR激活在哮喘發(fā)生中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

尹藝曉，張發(fā)艷，周生余

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250355；2山東大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是由多種細(xì)胞(如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)和細(xì)胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。近年來(lái)我國(guó)哮喘的發(fā)病率逐年上升，已成為嚴(yán)重威脅居民身體健康和生活質(zhì)量的公共衛(wèi)生問題之一。2014年全球哮喘防治創(chuàng)議第一次明確指出，哮喘是一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚不完全清楚。氣道炎癥是哮喘最基礎(chǔ)的病理改變，氣道高反應(yīng)、可逆性氣流受限及氣道重塑往往是氣道炎癥所引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，不管是哮喘的急性發(fā)作期還是慢性緩解期，控制氣道炎癥均是治療的關(guān)鍵。蛋白酶激活受體(PAR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，被凝血酶、組織因子等激活后，通過G蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)活化PKC等一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，繼而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。目前，PAR在哮喘氣道炎癥反應(yīng)中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。本文結(jié)合文獻(xiàn)就PAR激活在哮喘發(fā)生中作用機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 PAR概述

1991年Vu等首次分離出了PAR，并得到功能性人類凝血酶受體的cDNA，同時(shí)對(duì)該受體結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了闡述。目前認(rèn)為，PAR是一組具有7個(gè)跨膜單位的G蛋白偶聯(lián)受體超家族，由細(xì)胞外N端、3個(gè)細(xì)胞外袢、7個(gè)疏水跨膜區(qū)、3個(gè)細(xì)胞內(nèi)袢和細(xì)胞內(nèi)C端構(gòu)成。PAR包括4種亞型，即PAR1、PAR2、PAR3、PAR4，廣泛存在于全身各種組織細(xì)胞表面。其中，PAR1主要分布于血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中；PAR2主要分布于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)元、肌細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中；PAR3和PAR4主要分布于血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。

PAR可被多種內(nèi)源性、外源性蛋白酶和凝血因子等激活。PAR1的配體主要為凝血酶、FⅩa、激活蛋白C、激肽釋放酶、顆粒蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等；PAR2配體主要為凝血因子FⅩa、組織因子凝血因子復(fù)合物、胰蛋白酶、類胰蛋白酶、肥大細(xì)胞纖維蛋白溶酶及凝血酶激活PAR1產(chǎn)生的栓系配體等；PAR3和PAR4配體均為凝血酶。目前認(rèn)為，PAR有兩種激活方式，一種方式需要先形成一個(gè)新配體，即凝血酶或其他蛋白酶等配體與細(xì)胞外水蛭樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，裂解其胞外的N末端，釋放出一個(gè)多肽后，暴露一個(gè)新的氨基端，此為新配體，該配體再與受體膜外的第2個(gè)胞外袢結(jié)合，最終激活PAR；另一種方式為一般受體激活形式，即與栓系配體相對(duì)應(yīng)的PAR激活肽結(jié)合，直接激活細(xì)胞膜表面的PAR。激活后的PAR通過G蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)，主要是胞內(nèi)異三聚體或小分子量G蛋白，促進(jìn)Ca2+釋放，活化PKC等信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，繼而影響細(xì)胞形態(tài)、分泌、代謝和運(yùn)動(dòng)等。在呼吸系統(tǒng)中，PAR主要分布于肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肺腫瘤細(xì)胞等。在生理或病理狀態(tài)下，氣道上皮細(xì)胞均表達(dá)PAR1、PAR2和PAR4，病理狀態(tài)下尤為明顯。激活后的PAR可通過相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)多種細(xì)胞因子釋放，參與炎癥反應(yīng)，繼而導(dǎo)致肺組織損傷，在炎癥性肺疾病中具有重要作用[1]。

2 PAR在哮喘發(fā)生中的作用

哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性、可逆性氣流受限、氣道重塑為特征的慢性氣道炎癥性疾病。氣道長(zhǎng)期慢性炎癥損傷導(dǎo)致的氣道上皮纖維化、平滑肌增生肥大等，是哮喘發(fā)生、發(fā)展及晚期不可逆性改變的病理基礎(chǔ)[2]。因此，氣道炎癥是哮喘最基礎(chǔ)的病理改變。氣道慢性炎癥不僅導(dǎo)致各種凝血因子形成、纖維蛋白沉積和纖溶異常，氣道壁水腫而加重氣道狹窄，使哮喘癥狀加重[3]，還可激活PAR，繼而影響炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致氣道重塑[4，5]。

2.1 PAR激活對(duì)炎性細(xì)胞的影響 目前認(rèn)為，多種炎性細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)病過程，如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。

2.1.1 嗜酸性粒細(xì)胞 嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘氣道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其被激活后能釋放許多炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，包括氧自由基、白三烯、白細(xì)胞介素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等以及具有細(xì)胞毒性的嗜酸性細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、嗜酸性細(xì)胞過氧化物酶和主要堿基蛋白等，這些物質(zhì)均參與炎癥反應(yīng)，繼而引起氣道上皮損傷，增加氣道高反應(yīng)性[6]。在許多過敏性氣道疾病的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，PAR2激活可增加和活化炎性細(xì)胞，尤其是嗜酸性粒細(xì)胞。在蟑螂提取物誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)小鼠和氣道重塑BALB/c小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，PAR2拮抗劑可顯著降低模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量和肺組織膠原蛋白成分[7]，而PAR2基因敲除小鼠肺泡內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和肺泡蛋白漏出液明顯減少[8]。對(duì)蟑螂蛋白提取物測(cè)序分類發(fā)現(xiàn)了3種絲氨酸蛋白酶，這些蛋白酶均能夠通過PAR2受體激活鈣離子和MAPK信號(hào)通路[9]。

2.1.2 肥大細(xì)胞 肥大細(xì)胞屬于非特異性免疫細(xì)胞，與速發(fā)性哮喘的發(fā)生關(guān)系密切。肥大細(xì)胞能驅(qū)動(dòng)過敏反應(yīng)，激活后脫顆粒釋放的類胰蛋白酶能高效誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),增加氣道微血管通透性,刺激氣道上皮細(xì)胞釋放組織胺、白三烯和IL-8等多種生物活性成分和炎性介質(zhì)。肥大細(xì)胞膜上的PAR2激活后可促進(jìn)IL-18釋放，而IL-18又促進(jìn)肥大細(xì)胞聚集和PAR2表達(dá)增加[10]。因此，PAR2可間接對(duì)肥大細(xì)胞產(chǎn)生影響。

2.1.3 上皮細(xì)胞 研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞也能參與哮喘的發(fā)病過程。利用高致敏原鏈格孢菌濾液作用于人氣道上皮細(xì)胞，可通過激活PAR2，使體外細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高和體內(nèi)炎性細(xì)胞募集，而相關(guān)拮抗劑可阻斷這種反應(yīng)，提示PAR2可能通過影響炎性細(xì)胞而參與過敏性哮喘的發(fā)生[11]。

由于PAR2可影響嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種細(xì)胞功能，誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展。因此，有學(xué)者認(rèn)為單核細(xì)胞PAR2表達(dá)情況可判斷哮喘患者病情，有可能成為哮喘病情評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物[12]。

2.2 PAR激活對(duì)細(xì)胞因子的影響 細(xì)胞因子是引起或加重哮喘氣道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。目前普遍認(rèn)為，哮喘是一種Th1型細(xì)胞與Th2型細(xì)胞失衡的炎癥性疾病，Th1型細(xì)胞減少、Th2型細(xì)胞增加是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制。一些過敏原和裂解酶通過激活PAR2，活化呼吸道上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等使其釋放多種細(xì)胞因子，引起或加重氣道炎癥反應(yīng)。有學(xué)者將煙曲霉提取物作用于支氣管上皮細(xì)胞，通過激活PAR2和蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型信號(hào)通路，抑制Th1型細(xì)胞生成，使Th2型細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，繼而在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用[13]。

2.2.1 促進(jìn)IL-6、IL-8等炎性介質(zhì)釋放 研究證實(shí)，含有蛋白酶提取物的灰塵作用于人類支氣管上皮細(xì)胞可激活PAR1和PAR2，通過PKC激酶途徑促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞釋放包括IL-6、IL-8、TNF-α及趨化因子CXCL1、CXCL2等多種炎性介質(zhì)，在氣道炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[14]。IL-6是刺激T、B細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、促進(jìn)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞功能、誘導(dǎo)急性期炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子；通過促進(jìn)Th2型細(xì)胞比例增加，抑制Th1型細(xì)胞分化參與哮喘氣道炎癥反應(yīng)過程。作為趨化因子的IL-8主要趨化和激活中性粒細(xì)胞，使炎癥細(xì)胞向氣管募集、遷移或浸潤(rùn)，并促進(jìn)白三烯分泌，繼而引起支氣管收縮。Jairaman等[15]采用塵螨和蟑螂的提取物刺激支氣管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)至少能部分通過激活PAR2，引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放激活的鈣通道調(diào)控因子STIM1蛋白和Orai1蛋白活化，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞后激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化T細(xì)胞核因子(NFAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過NFAT蛋白的脫磷酸化及核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活下游細(xì)胞因子IL-6和IL-8基因的轉(zhuǎn)錄。Ramu等[16]采用房屋塵螨、鏈格孢菌、艾蒿和歐洲白樺四種物質(zhì)的提取物作用于支氣管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)可通過激活PAR，劑量依賴性釋放ATP和IL-8，而絲氨酸蛋白酶抑制劑可抑制上述過敏原誘導(dǎo)的IL-8 mRNA表達(dá)。以上研究表明，不同過敏源均通過PAR激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-6、IL-8等產(chǎn)生，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

2.2.2 促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)釋放 研究證實(shí)，MCP-1對(duì)單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等有趨化和激活作用，并可導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒。GM-CSF可刺激髓樣單核細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，激活巨噬細(xì)胞，刺激嗜酸性粒細(xì)胞分化和發(fā)育，使嗜酸性粒細(xì)胞釋放大量白三烯和堿性蛋白，繼而損傷呼吸道上皮，加重哮喘癥狀。Lee等[17]利用表皮塵螨提取液刺激中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)塵螨提取液可激活PAR2，通過PAR2/PI3K/Akt/ERK/NF-κB信號(hào)途徑轉(zhuǎn)錄表達(dá)MCP-1和GM-CSF，但塵螨提取液還具有抗中性粒細(xì)胞凋亡作用。因此，PAR及其信號(hào)通路是否與中性粒細(xì)胞哮喘表型有一定關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

2.2.3 促進(jìn)TNF-α和IL-18釋放 TNF-α亦是一種具有誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘發(fā)IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附、游走、浸潤(rùn)及中性粒細(xì)胞脫顆粒，導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)加重和氣道高反應(yīng)性。Kim等[18]利用德國(guó)蟑螂提取物體外作用于肺泡巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PAR2被激活并能刺激細(xì)胞釋放TNF-α；在哮喘模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-5、IL-13水平均升高。IL-18與PAR2激活亦存在相關(guān)性。IL-18是與哮喘炎癥反應(yīng)，尤其是肥大細(xì)胞募集有關(guān)的細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并刺激Th2型細(xì)胞因子和IgE產(chǎn)生。在中度和重度哮喘小鼠模型中，IL-18和類胰蛋白酶均明顯升高，二者密切相關(guān)；類胰蛋白酶能通過肥大細(xì)胞上的PAR2促進(jìn)IL-18釋放，而IL-18又可促進(jìn)IL-4水平升高、肥大細(xì)胞聚集和PAR2表達(dá)增加[10]。

2.3 PAR激活對(duì)氣道重塑的影響 研究證實(shí)，促炎因子長(zhǎng)期持續(xù)存在可導(dǎo)致氣道平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終出現(xiàn)氣道重塑，繼而影響肺功能。PAR2激活具有促進(jìn)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖作用。Allard等[19]對(duì)來(lái)源于哮喘患者的氣道平滑肌細(xì)胞給予PAR2激動(dòng)劑干預(yù)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)效果更明顯；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種增殖作用與激活ERK1/2磷酸化通路有關(guān)。因平滑肌細(xì)胞是氣道重塑的關(guān)鍵細(xì)胞，由此推測(cè)PAR2對(duì)氣道重塑有一定作用，這可能為今后難治性哮喘的治療提供了新思路。

目前，關(guān)于PAR1對(duì)氣道重塑影響的研究報(bào)道相對(duì)較多。人氣道平滑肌細(xì)胞PAR1被凝血因子Ⅹa激活后，在膜聯(lián)蛋白A2、整合蛋白和整聯(lián)蛋白參與下，刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、細(xì)胞周期蛋白D1、纖維生長(zhǎng)因子2、血小板源性生長(zhǎng)因子B、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等，上述細(xì)胞因子均參與氣道重塑，在哮喘發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]。PAR1通過促進(jìn)氣道組織TGF-β高表達(dá)而加劇氣道重塑。TGF-β一直被認(rèn)為是氣道重構(gòu)的關(guān)鍵因素，不僅能促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞增生、上皮下膠原沉積和纖維化，還能促使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在小鼠哮喘模型氣道組織中發(fā)現(xiàn)，PAR1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，PAR1激活后通過ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使上皮細(xì)胞中TGF-β表達(dá)升高，并促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致氣道重塑[21，22]。Gong等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，TGF-β使上皮細(xì)胞鈣黏蛋白向神經(jīng)鈣黏蛋白及α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)轉(zhuǎn)化也是通過激活PAR1實(shí)現(xiàn)的，而PAR1拮抗劑可恢復(fù)上皮細(xì)胞鈣黏蛋白活性而抑制α-SMA表達(dá)，阻止纖維化發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者氣道組織TGF-β和基質(zhì)金屬蛋白酶高表達(dá)造成的氣道重塑和持續(xù)氣流受限是重癥哮喘或激素治療效果不佳的一個(gè)重要原因[24]。深入研究PAR1、PAR2或其信號(hào)通路可能對(duì)重癥或難治性哮喘的治療有一定幫助。

綜上所述，PAR激活，尤其是PAR2和PAR1激活可通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，造成氣道慢性炎癥反應(yīng)和氣道重塑，引起或加重哮喘。深入研究PAR在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用及研發(fā)PAR阻斷劑將有望為哮喘的預(yù)防、控制及治療帶來(lái)希望。