LINE-1的低甲基化在癌癥中的研究進(jìn)展*

李佳慈，李克秋，景亞青 綜述，李 光 審校

(天津醫(yī)科大學(xué)遺傳系，天津 300070)作者簡(jiǎn)介：李佳慈(1993-)，在讀碩士，主要從事環(huán)境與健康研究。 △ 通信作者，E-mail:lig@tmu.edu.cn。

轉(zhuǎn)座子，即跳躍基因，是一段在基因組中能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄的方式移動(dòng)到其他基因座上的DNA序列。轉(zhuǎn)座子的“跳躍”功能是通過(guò)基因編碼的蛋白質(zhì)(如DNA轉(zhuǎn)座酶，逆轉(zhuǎn)錄酶)來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)的[1]。根據(jù)轉(zhuǎn)座過(guò)程中依賴(lài)的中間媒介，轉(zhuǎn)座子可被分為DNA 轉(zhuǎn)座子和RNA 轉(zhuǎn)座子。DNA 轉(zhuǎn)座子是通過(guò)“切割-粘貼”機(jī)制轉(zhuǎn)座的一類(lèi)轉(zhuǎn)座子，它能編碼一種轉(zhuǎn)座酶,特異識(shí)別染色體DNA 中的轉(zhuǎn)座序列,將其切割下來(lái)并插入到新的位點(diǎn)[2]。

RNA 轉(zhuǎn)座子又被稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)座子,它通過(guò)DNA元件轉(zhuǎn)錄成RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后插入基因組中某一新位點(diǎn)。分散在真核生物基因組中的大量逆轉(zhuǎn)座子是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定的因素，可引起基因組序列的刪除、擴(kuò)增、倒位、移位、斷裂、同源序列重組等現(xiàn)象。逆轉(zhuǎn)座子主要有兩類(lèi):長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long-terminal repeats，LTR )和非LTR 的反轉(zhuǎn)座子。人們最為熟知的LTR轉(zhuǎn)座子,占人類(lèi)基因組的8%。非LTR 的反轉(zhuǎn)座子包括自主性和非自主性?xún)煞N。自主性反轉(zhuǎn)座子即長(zhǎng)散布核元件(long interspersed nuclear elements,LINE)，主要成員是LINE-1；非自主性反轉(zhuǎn)座子有短散布核元件(short interspersed nuclear elements,SINE)、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)和SINE-VNTR-Alu的結(jié)合序列SVA。SINEs和SVA不編碼任何蛋白,但是它們的轉(zhuǎn)座要依賴(lài)于活性LINE-1,故也將其形象地稱(chēng)為“LINE-1的寄生蟲(chóng)”。本文將重點(diǎn)闡述LINE-1的研究進(jìn)展[3]。

1 LINE-1

LINE-1是LINE中的一種最為重要的重復(fù)序列，是在人類(lèi)基因組中唯一可以自主轉(zhuǎn)座的逆轉(zhuǎn)座子。盡管人類(lèi)基因組中有超過(guò)50 000個(gè)LINE-1序列，但是大多數(shù)由于基因重排、點(diǎn)突變、5′端截?cái)嗟仍蚴セ钚?，只?0～100個(gè)LINE-1序列在人體中存在活性，并且其活性部位存在個(gè)體差異性[4]。一個(gè)有活性的LINE-1序列長(zhǎng)約6 500 bp，主要集中在腺嘌呤、胸腺嘧啶(AT)富集區(qū)。LINE-1及其編碼的反轉(zhuǎn)錄酶可作用于其他非自主反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座過(guò)程，LINE-1參與轉(zhuǎn)座生成的DNA序列，累加約占到人類(lèi)基因組的30%[5]。

2 LINE-1轉(zhuǎn)座的調(diào)控模式

LINE-1的轉(zhuǎn)座受多種因素的調(diào)控，如DNA甲基化、RNA剪接和多聚腺苷酸、細(xì)胞內(nèi)蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等。

甲基化調(diào)控模式：DNA甲基化發(fā)生在原生殖細(xì)胞中，它是在DNA堿基上添入甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾現(xiàn)象。DNA的甲基化在許多生物過(guò)程中有著重要的作用[6]。在缺乏甲基化轉(zhuǎn)移酶-3L(DNMT-3L)的減數(shù)分裂異常的雄性小鼠中可以觀察到LINE-1的過(guò)表達(dá)。在小鼠的生殖細(xì)胞中，通過(guò)基因敲除，使 DNMT3甲基化酶家族低表達(dá)，LINE-1轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)一步表明了甲基化作用是LINE-1表達(dá)的主要調(diào)控作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LINE-1的5′UTR區(qū)域存在大量的CpG序列高甲基化，高甲基化的CpG序列與甲基化 CpG結(jié)合蛋白MeCP結(jié)合而沉默。此蛋白在上皮癌和白血病的細(xì)胞系中可抑制 LINE-1的移動(dòng)，這種抑制也發(fā)生在體細(xì)胞，而對(duì)于低甲基化的生殖細(xì)胞和人類(lèi)腫瘤細(xì)胞抑制程度會(huì)減弱。BECK等[4]發(fā)現(xiàn)在人體組織中DNA甲基化對(duì)LINE-1的表達(dá)有影響。

RNA剪接和多聚腺苷酸調(diào)控模式：靶序列引發(fā)反轉(zhuǎn)錄(TPRT)機(jī)制介導(dǎo)人LINE-1 mRNA逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座，此過(guò)程中剪接位點(diǎn)是有功能的，它的激活可以導(dǎo)致產(chǎn)生更短的LINE-1 mRNA片段，短片段LINE-1 mRNA可能會(huì)構(gòu)成逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。實(shí)際上在組織中，LINE-1 mRNA剪接是抑制LINE-1表達(dá)的一種調(diào)控機(jī)制[7]。LINE-1包括許多潛在的多腺苷酸化信號(hào)，這些信號(hào)可以生成更短的用于逆轉(zhuǎn)錄的LINE-1 mRNAs序列，這種方式可能對(duì)LINE-1的表達(dá)有調(diào)控作用。

抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)調(diào)控模式：WISSIGN等[8]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的多種細(xì)胞中，APOBEC3胞苷脫氨酶家族，尤其是APOBEC3A(A3A)和APOBEC3B(A3B)，對(duì)LINE-1逆轉(zhuǎn)錄抑制作用較強(qiáng)。RICE等[9]在體外培養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Trex1基因和SAMHD1基因過(guò)表達(dá)均可抑制LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄。最近有研究表明：莫洛尼白血病病毒10(MOV10)對(duì)人LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄也有抑制作用[10]。

在LINE-1的幾種調(diào)控模式中，LINE-1甲基化是一種最為重要的調(diào)控方式。LINE-1在人類(lèi)幾乎所有腫瘤細(xì)胞中因其去甲基化而處于高表達(dá)狀態(tài)，并且高表達(dá)的LINE-1能促進(jìn)細(xì)胞增殖，如肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞HepG2、乳腺癌細(xì)胞MCF-7，而在正常組織細(xì)胞中卻處于沉默狀態(tài)。有研究表明LINE-1的這種激活與表達(dá)可能對(duì)基因組產(chǎn)生巨大的破壞：如突變、基因的不穩(wěn)定[11]，其具體功能尚在研究中。LIU等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LINE-1以反轉(zhuǎn)座的形式，強(qiáng)烈的抑制某些腫瘤細(xì)胞在G1/S/G2/M期的停留。LINE-1與細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為之間的關(guān)系是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

3 LINE-1低甲基化與癌癥

LINE-1的低甲基化是癌癥中常見(jiàn)的表觀遺傳現(xiàn)象，對(duì)癌癥的發(fā)生有一定的影響。在正常情況下，LINE-1是高度甲基化的。但是，有研究表明，在上皮癌、大腸癌、胃癌等癌癥中，LINE-1表現(xiàn)明顯的低甲基化[13-15]。LINE-1的甲基化降低導(dǎo)致LINE-1的反轉(zhuǎn)錄活性增加，影響細(xì)胞正常的功能，增加癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

目前對(duì)于LINE-1的插入在癌癥的發(fā)生和演進(jìn)中的機(jī)制存在著幾種猜想：(1)環(huán)境因素最初改變了LINE-1啟動(dòng)子甲基化的狀態(tài)，從而增加了LINE-1的轉(zhuǎn)錄活性，新的LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座進(jìn)入到一段致癌的區(qū)域，這一過(guò)程可能會(huì)造成癌癥的發(fā)生；(2)一旦癌癥發(fā)生，LINE-1啟動(dòng)子區(qū)去甲基化可能也會(huì)增加，進(jìn)而激發(fā)反義的啟動(dòng)子區(qū)和附近的基因[16]。

3.1LINE-1的低甲基化對(duì)常見(jiàn)癌癥的影響 HOSHIMOTO等[13]認(rèn)為L(zhǎng)INE-1的低甲基化可以作為食管鱗狀細(xì)胞癌一個(gè)早期的生物標(biāo)志。早期的食管鱗狀細(xì)胞癌中LINE-1的低甲基化水平和細(xì)胞侵襲的深度有密切的聯(lián)系。

此外，ZHU等[14]報(bào)道顯示，在食管鱗狀細(xì)胞癌中LINE-1的甲基化水平與CDK mRNA和CDK蛋白的表達(dá)水平有顯著的聯(lián)系。LINE-1表觀遺傳的變化伴隨著多耐藥基因MDR1表達(dá)的激活，導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物P-糖蛋白作用異常，細(xì)胞耐藥性降低，增大腫瘤細(xì)胞變異的可能性。

3.2LINE-1的低甲基化對(duì)腎母細(xì)胞瘤的影響 CHANG等[15]發(fā)現(xiàn)，LINE-1甲基化和腎母細(xì)胞瘤的端粒長(zhǎng)度有明顯的聯(lián)系。低甲基化通過(guò)DNA損傷或其他途徑促進(jìn)LINE-1轉(zhuǎn)錄從而縮短端粒長(zhǎng)度。用低甲基化藥物5-脫氧氮雜胞苷處理腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中相對(duì)端粒長(zhǎng)度縮短，LINE-1甲基化降低。這些研究結(jié)果都表明，在腎母細(xì)胞瘤中普遍存在LINE-1的甲基化，并且LINE-1的低甲基化是端粒長(zhǎng)度縮短的原因之一。

3.3LINE-1的低甲基化對(duì)大腸癌的影響 TANG等[16]發(fā)現(xiàn)LINE-1的低甲基化程度與不同臨床表現(xiàn)和分子特征的大腸癌有關(guān)，LINE-1的低甲基化是檢測(cè)大腸癌的一個(gè)可能的生物標(biāo)記。在患有大腸癌的中國(guó)患者中，人黏液膜上LINE-1的甲基化程度降低；然而，LINE-1的甲基化在人相鄰正常的腸黏液膜中起著關(guān)鍵的作用，此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程有著重要的影響[17]。

3.4LINE-1的低甲基化對(duì)肝細(xì)胞癌的影響 在HARADA等[18]的報(bào)道中顯示，在LINE-1低甲基化的肝細(xì)胞癌中周期蛋白依賴(lài)性激酶CDK6表達(dá)量明顯升高，這說(shuō)明LINE-1的低甲基化通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，增大肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。ZHU等[19]認(rèn)為，在肝細(xì)胞癌中LINE-1的低甲基化通過(guò)致癌基因c-MET的激活，對(duì)肝細(xì)胞癌預(yù)后的總生存數(shù)和無(wú)病存活數(shù)產(chǎn)生影響，這與肝細(xì)胞癌的發(fā)病進(jìn)展有一定的聯(lián)系。此外，有研究顯示，LINE-1上ORF1蛋白可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖并且可以減少化療藥物的細(xì)胞毒性[20]。而且，新的LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能抑制大腸癌腫瘤突變蛋白(MCC)，并且激活肝細(xì)胞癌中的腫瘤發(fā)生抑制因子ST18[21]。綜上所述，LINE-1的低甲基化有可能作為肝細(xì)胞癌診斷及預(yù)后的一個(gè)生物標(biāo)記。

3.5LINE-1的低甲基化對(duì)其他癌癥的影響 在預(yù)測(cè)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤及葡萄胎方面，LINE-1的部分低甲基化發(fā)生在惡性轉(zhuǎn)化出現(xiàn)之前，LINE-1可能是一個(gè)有前景的生物標(biāo)記[22]。在乳腺癌的研究進(jìn)展當(dāng)中，LINE-1的低甲基化可能作為一個(gè)早期的診斷標(biāo)準(zhǔn)； 而Alu家族在乳腺癌的癌癥發(fā)病進(jìn)展中可能作為一個(gè)晚期的診斷標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞膜受體HER2豐富的亞型中，Alu和LINE-1的顯著低甲基化，這可能和特殊亞型的不穩(wěn)定性有關(guān)[23]。此外，在肺癌、膀胱癌等的研究中，也發(fā)現(xiàn)了不同程度的LINE-1甲基化的降低，LINE-1的甲基化降低間接反映了全基因組甲基化水平的降低，LINE-1甲基化降低會(huì)造成致癌基因的過(guò)表達(dá)，從而加大了癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

4 LINE-1低甲基化與癌癥的不良預(yù)后的關(guān)系

隨著惡性腫瘤表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，LINE-1序列5′端啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化狀態(tài)與癌癥的不良預(yù)后是密切相關(guān)的。有文獻(xiàn)報(bào)道，在95例肝癌患者中，LINE-1甲基化高組(甲基化程度大于75.91%)患者的術(shù)后生存率和總生存率都明顯高于LINE-1甲基化低組(甲基化程度小于或等于75.91%)。在浸潤(rùn)性乳腺癌患者的10年隨訪中發(fā)現(xiàn)，LINE-1的低甲基化與無(wú)病生存時(shí)間無(wú)關(guān)。在皮膚癌中，LINE-1 CpG2和CpG3兩個(gè)位點(diǎn)的低甲基化與惡性黑色素瘤的改善預(yù)后有關(guān)，且LINE-1 CpG3的低甲基化與惡性黑色素瘤的改善預(yù)后關(guān)系更為顯著。

LINE-1低甲基化可增加LINE-1 mRNA表達(dá)，激活逆轉(zhuǎn)錄活性，因此抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)座可作為抗腫瘤藥物研發(fā)的新思路。2006年獲批的一項(xiàng)專(zhuān)利顯示，在治療中利用RNA干擾技術(shù)降低反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)水平，從而使腫瘤組織增殖減慢，并且誘導(dǎo)終末分化。研究者發(fā)現(xiàn)在高LINE-1 轉(zhuǎn)錄活性的Hela細(xì)胞中，抗病毒藥物核苷類(lèi)似物(反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)司他夫定、齊多夫定、拉米夫定聯(lián)合使用能有效抑制LINE-1的轉(zhuǎn)錄[24]。雖然這些研究目前只是臨床前的試驗(yàn)階段，但LINE-1與癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系近些年來(lái)已經(jīng)引起了科研工作者的興趣，相信在未來(lái)的時(shí)間內(nèi)抑制LINE-1活性藥物會(huì)成為治療癌癥的福音。