宏基因組測(cè)序在感染性疾病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

李林海，陳麗丹，肖 斌，孫朝暉

感染性疾病是臨床常見(jiàn)疾病之一，多為細(xì)菌、病毒和真菌等病原體及其產(chǎn)物所引起的局部或全身性炎癥或器官功能障礙，具有較大的危害性和較高的病死率。在快速準(zhǔn)確地查明病因的基礎(chǔ)上，選擇合理的治療方案，可有效地控制疾病的發(fā)生發(fā)展。但目前，病原體的常規(guī)檢測(cè)方法存在陽(yáng)性率低、周期長(zhǎng)、對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求比較高等局限。

宏基因組測(cè)序是指對(duì)特定環(huán)境樣品中的全部病原體基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，該方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效地獲得整個(gè)病原體群體的基因組信息。宏基因組測(cè)序不依賴于病原體的分離培養(yǎng)，可以得到環(huán)境中豐度較低甚至是痕量病原體的信息，目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、食品安全和環(huán)境污染防治等各個(gè)領(lǐng)域[1-3]。近年來(lái)，宏基因組測(cè)序越來(lái)越多的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷領(lǐng)域，如感染類型診斷、抗性基因的鑒定和傳染病的防控等[4-9]。本文對(duì)感染性疾病的現(xiàn)狀、病原體的高通量測(cè)序技術(shù)概況及宏基因組測(cè)序在感染性病原體檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在進(jìn)一步揭示宏基因組測(cè)序在感染性疾病中的重要作用與應(yīng)用價(jià)值。

1 感染性疾病及實(shí)驗(yàn)診斷現(xiàn)狀

目前，全球感染性疾病的發(fā)病率有所上升，病原體呈現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化的發(fā)展趨勢(shì)。重癥急性呼吸綜合征、新型冠狀病毒感染、新變異型克雅病、H7N9禽流感等新發(fā)感染性疾病不斷出現(xiàn)[9]。而HIV、多重或廣譜耐藥的結(jié)核分枝桿菌、沙眼支原體等經(jīng)典感染性疾病病原體又死灰復(fù)燃或出現(xiàn)新的致病特征。各種新發(fā)和再發(fā)的感染性疾病、不易發(fā)現(xiàn)的多重感染以及不明病因的發(fā)熱等，都給人類健康帶來(lái)了巨大的威脅，因此，臨床上對(duì)感染性疾病診斷的準(zhǔn)確性和時(shí)效性提出了更高的要求。

在感染性疾病領(lǐng)域中，獲得病原體的活體（對(duì)于細(xì)菌、真菌、病毒而言，主要是培養(yǎng)陽(yáng)性），是感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但病原體的體外培養(yǎng)耗時(shí)普遍較長(zhǎng)，操作步驟繁瑣，且絕大多數(shù)病原體不可培養(yǎng)；免疫學(xué)方法（如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、免疫熒光法和酶標(biāo)斑點(diǎn)免疫法等）操作簡(jiǎn)單，但由于病原體種類繁多，已研發(fā)的抗原、抗體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求；PCR檢測(cè)具有極高的靈敏度和特異性，但無(wú)法完成高通量篩查，檢出率較低；基因芯片技術(shù)只能對(duì)已知的病原體基因組進(jìn)行意向性篩查，而無(wú)法檢測(cè)新的未知病原體[10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%的感染性疾病患者因傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法確定病原體信息，不能得到及時(shí)有效地救治，從而使病情惡化。因此，快速、特異且高通量的病原體檢測(cè)方法，對(duì)有效診斷和及時(shí)防治感染性疾病具有重要的意義[11]。

2 病原體的高通量測(cè)序技術(shù)

目前，以感染性疾病病原體為檢測(cè)目標(biāo)的高通量測(cè)序技術(shù)包括全基因組測(cè)序、16s rRNA基因測(cè)序和宏基因組測(cè)序，不同的方法檢測(cè)目的不同。

全基因組測(cè)序可以得到病原體的全部基因組序列，能夠更全面地了解病原體的遺傳信息，研究樣品中的功能基因及其在環(huán)境中的作用。但全基因組測(cè)序分析費(fèi)用高、周期長(zhǎng)，其檢測(cè)效率和實(shí)驗(yàn)步驟決定了該技術(shù)更多應(yīng)用于科學(xué)研究和病原體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立[12]。

16s rRNA測(cè)序能夠檢測(cè)高度保守的16s核糖體亞基，準(zhǔn)確地鑒定已知細(xì)菌和發(fā)現(xiàn)新細(xì)菌，分析樣品中病原體物種的豐度和分布情況，無(wú)須構(gòu)建文庫(kù)，極大地縮減了分析周期及成本。該技術(shù)的缺點(diǎn)是無(wú)法對(duì)不同物種的基因功能進(jìn)行分析，也不能鑒定和區(qū)分病毒、真菌及寄生蟲(chóng)等其他病原體。

宏基因組學(xué)是以某一特定環(huán)境樣品中的病原體群體基因組為研究對(duì)象，以測(cè)序分析為研究手段，以病原體多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的病原體研究方法?；诤昊蚪M學(xué)的高通量測(cè)序可以分析病原體群體基因組成及功能，解讀病原體群體的多樣性與豐度，探求病原體與環(huán)境、宿主之間的關(guān)系，挖掘具有應(yīng)用價(jià)值的基因資源，開(kāi)發(fā)新的病原體活性物質(zhì)。宏基因組測(cè)序直接從環(huán)境樣品中提取基因組DNA后進(jìn)行測(cè)序分析，將所測(cè)序列與專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得出樣本中所含物種的信息；通過(guò)嚴(yán)格的宏基因組拼接，可獲得較長(zhǎng)的DNA片段；若測(cè)序達(dá)到一定的通量，可直接獲得一個(gè)或多個(gè)病原體基因組草圖；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行功能分析及病原體群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析，可更準(zhǔn)確地反映病原體生存的真實(shí)狀態(tài)。該方法不僅可以避開(kāi)傳統(tǒng)方法（培養(yǎng)法、血清法和 PCR 法）的局限性，快速地檢測(cè)出已知病原體，還可以發(fā)現(xiàn)許多未知病原體，直接分析出樣本中的病原體譜、豐度和分布情況，了解潛在病原體的變化情況，有助于診斷一些不明病原體引發(fā)的感染性疾病。隨著周期短、通量高、成本低的第二代、第三代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，宏基因組測(cè)序方法發(fā)生了巨大的變化[13-16]，在獲得海量的測(cè)序數(shù)據(jù)后，能夠快速、全面地分析病原體群落結(jié)構(gòu)，為研究病原體組提供了極大便利?；诤昊蚪M測(cè)序的病原體組研究已滲透到各個(gè)領(lǐng)域，尤其在科學(xué)研究與臨床診斷領(lǐng)域，更是取得了極大發(fā)展。

3 宏基因組測(cè)序在感染性病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來(lái)，隨著病原體的進(jìn)化與變異，抗生素、激素、免疫抑制劑的大范圍使用及惡性腫瘤、器官移植患者日益增加，許多新發(fā)的感染性問(wèn)題不斷出現(xiàn)，疑難感染病例也不斷增多，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法難以滿足當(dāng)前的臨床需求。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，一系列重要病原體全基因組數(shù)據(jù)被陸續(xù)公布，感染性疾病的病原譜逐個(gè)被解開(kāi)，人們對(duì)病原體有了更多的認(rèn)識(shí)，這些都為快速、準(zhǔn)確、全面地診斷病原體的宏基因組帶來(lái)了新的契機(jī)[17-20]。

3.1 宏基因組測(cè)序在細(xì)菌感染性疾病診斷中的應(yīng)用 細(xì)菌是感染性疾病最常見(jiàn)的病原體之一。培養(yǎng)法是細(xì)菌分離的標(biāo)準(zhǔn)方法，但細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間普遍較長(zhǎng)，且許多細(xì)菌不易培養(yǎng)，多重感染易被忽視，而針對(duì)不明原因發(fā)熱患者的病原體檢測(cè)更是臨床診斷的難點(diǎn)。采用宏基因組測(cè)序可以避開(kāi)傳統(tǒng)培養(yǎng)法的局限，直接對(duì)樣本基因組進(jìn)行測(cè)序，迅速鑒定樣本中的已知病原體，有效發(fā)現(xiàn)各種未知病原體。菌血癥是ICU患者常見(jiàn)的嚴(yán)重感染性疾病，須要對(duì)病原體進(jìn)行快速診斷，從而有針對(duì)性地進(jìn)行抗菌治療。Long等[21]對(duì)78例ICU患者的血漿分別進(jìn)行宏基因組二代測(cè)序和血培養(yǎng)，結(jié)果顯示，宏基因組二代測(cè)序方法的病原體檢出率為30.77%，而血培養(yǎng)法僅為12.82%，表明宏基因組測(cè)序在病原體檢測(cè)中具有更高的靈敏性。Abril等[22]將1例膿毒癥患者血漿中的游離細(xì)菌DNA進(jìn)行宏基因組測(cè)序，24 h內(nèi)便檢測(cè)出嗜二氧化碳噬細(xì)胞菌（Capnocytophaga canimorsus）基因序列高度富集，并使用16s rRNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)，體現(xiàn)出宏基因組技術(shù)相對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有更高的效率。單核細(xì)胞增多性李斯特菌常伴隨EB病毒感染，引起傳染性單核細(xì)胞增多癥，也可引發(fā)腦膜炎、菌血癥等，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)在早期很難發(fā)現(xiàn)感染該菌。Yao等[23]對(duì)3例臨床疑似單核細(xì)胞增多性李斯特菌感染的腦膜炎患者的腦脊液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果為單核細(xì)胞增多性李斯特菌陰性，而腦脊液宏基因組測(cè)序確診為單核細(xì)胞增多性李斯特菌感染，這是國(guó)際上首次將宏基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于單核細(xì)胞增多性李斯特菌的診斷。Ye等[24]采用宏基因組二代測(cè)序方法檢出1例病因不明且常規(guī)抗生素治療無(wú)效的白血病患兒為痤瘡丙酸桿菌感染，在進(jìn)行針對(duì)性靶向治療后，患者病情迅速好轉(zhuǎn)。

感染性疾病常見(jiàn)的病原體還包括支原體、衣原體、真菌和寄生蟲(chóng)等。宏基因組測(cè)序在這些病原體的臨床檢測(cè)中同樣發(fā)揮了重要的作用[25-26]。Andersson等[27]用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)陰道拭子進(jìn)行宏基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了沙眼衣原體的染色體和質(zhì)粒，可見(jiàn)對(duì)陰道拭子標(biāo)本直接測(cè)序能夠用于檢測(cè)多種細(xì)菌的基因組序列。宏基因組測(cè)序在寄生蟲(chóng)診斷方面的研究還比較少，未來(lái)潛在的研究方向包括寄生蟲(chóng)的基因組特征與流行病學(xué)的關(guān)聯(lián)性，以及寄生蟲(chóng)對(duì)腸道微生態(tài)環(huán)境的影響等。

3.2 宏基因組測(cè)序在病毒感染性疾病診斷中的應(yīng)用 目前，病毒感染的診斷以免疫學(xué)檢測(cè)為主要方法，PCR檢測(cè)等分子診斷方法的應(yīng)用也較為廣泛，但兩種方法均須預(yù)判可能的病毒類型，并且無(wú)法檢測(cè)未知的病毒。利用宏基因組學(xué)檢測(cè)病原體時(shí)，無(wú)須預(yù)判病原體的范圍，也不存在靶向測(cè)序法中的偏倚性。隨著高通量測(cè)序耗時(shí)的減少和成本的不斷降低，宏基因組測(cè)序在病毒感染診斷等領(lǐng)域同樣有著廣闊的應(yīng)用前景[28]。Ni等[29]對(duì)5例ICU疑難重癥患者的血漿樣本DNA進(jìn)行宏基因組測(cè)序，快速檢出其中含有EB病毒DNA，說(shuō)明宏基因組測(cè)序?qū)τ趥鹘y(tǒng)的EB病毒免疫學(xué)檢測(cè)是一個(gè)很好的補(bǔ)充。Piantadosi等[30]報(bào)道了1例經(jīng)常接觸蜱、嚙齒動(dòng)物與蝙蝠的嚴(yán)重進(jìn)行性腦炎患者，利用宏基因組測(cè)序技術(shù)，在4 d內(nèi)鑒定出該患者感染了罕見(jiàn)的博瓦桑病毒。相對(duì)于傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法，該患者的病毒檢出時(shí)間提早了4周，說(shuō)明宏基因組測(cè)序可應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)類病毒感染的快速檢測(cè)。Guan等[31]對(duì)4例疑似中樞神經(jīng)病毒感染患者的腦脊液進(jìn)行宏基因組測(cè)序，均檢出病毒感染，同時(shí)用PCR進(jìn)行了二次驗(yàn)證，結(jié)果與宏基因組測(cè)序結(jié)果吻合。Somasekar等[32]對(duì)204例成年急性肝衰竭患者（17例患者已知為HAV或HBV感染）的血清樣本進(jìn)行病毒感染分析，通過(guò)宏基因組二代測(cè)序鑒定出8例新病毒感染病例，同時(shí)鑒定出一些之前未被檢測(cè)出的多重感染病例，表明宏基因組二代測(cè)序能夠較好地檢出低豐度的多重感染病原體。

4 宏基因組測(cè)序存在的問(wèn)題及展望

目前，宏基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè)還存在很多實(shí)際問(wèn)題。①臨床標(biāo)本數(shù)量多，擺放雜，可能會(huì)出現(xiàn)交叉污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果或數(shù)據(jù)丟失，特別是細(xì)菌感染樣本中可能混有大量白細(xì)胞，導(dǎo)致宿主信息干擾讀取的目標(biāo)序列；病原體數(shù)據(jù)也可能與正常菌群混淆或者相互干擾。目前還沒(méi)有建立統(tǒng)一的各類臨床標(biāo)本宏基因組測(cè)序的前處理標(biāo)準(zhǔn)；②高通量測(cè)序會(huì)產(chǎn)生大批量的數(shù)據(jù)，需要專業(yè)的生物信息團(tuán)隊(duì)進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，由于許多病原體的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)并不完善，所以分析的成本和時(shí)間目前難以控制；③對(duì)于許多感染性疾病，其特征性的病原譜尚不明確，僅獲取患者樣本的病原體信息尚不足以明確致病原因和疾病發(fā)展過(guò)程，難以實(shí)現(xiàn)精確治療和干預(yù)；④尚未開(kāi)展與常規(guī)檢測(cè)方法比對(duì)的規(guī)律性研究，檢測(cè)的敏感度和特異性需要臨床大數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)及與現(xiàn)有方法的比較；⑤目前大部分的研究和應(yīng)用是以病原體的定性分析為主，須要進(jìn)一步擴(kuò)大數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模，將定性信息轉(zhuǎn)變?yōu)槎啃畔?，以確保臨床診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性[33-34]。

盡管宏基因組二代測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，但是距離真正應(yīng)用于感染性疾病檢測(cè)還有許多差距和不足。目前，除了一些一類通用測(cè)序試劑和儀器設(shè)備，僅有應(yīng)用于產(chǎn)前篩查的二代測(cè)序試劑獲得我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市，而其他研究領(lǐng)域，包括感染性病原體篩查的二代測(cè)序應(yīng)用，仍處于產(chǎn)品的注冊(cè)檢測(cè)、優(yōu)化、臨床試驗(yàn)等一系列準(zhǔn)備工作階段。2016年5月13日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了一項(xiàng)關(guān)于二代基因測(cè)序器械的指導(dǎo)草案，該草案對(duì)使用二代測(cè)序儀器檢測(cè)感染性疾病病原體及毒力標(biāo)志物的宏基因組測(cè)序驗(yàn)證進(jìn)行了規(guī)范化指導(dǎo)。這是目前在該領(lǐng)域應(yīng)用的二代測(cè)序儀器可供參考的信息。此外，針對(duì)宏基因測(cè)序檢測(cè)感染性病原體實(shí)驗(yàn)操作方案及結(jié)果評(píng)價(jià)，目前仍缺乏統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，采用宏基因組測(cè)序技術(shù)可以突破傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性。針對(duì)難以培養(yǎng)的病原體和不明病因無(wú)法預(yù)判的感染病患，利用高通量宏基因組測(cè)序技術(shù)和專業(yè)的病原體數(shù)據(jù)庫(kù)，可直接對(duì)樣本中的病原體DNA進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)軟件分析得出覆蓋齊全、準(zhǔn)確可靠的樣本病原體遺傳信息。今后須要進(jìn)一步推進(jìn)數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)、罕見(jiàn)病原體基因譜的研究、病原體的機(jī)制研究以及宏基因組測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)化流程的建立等工作。相信未來(lái)宏基因組測(cè)序技術(shù)將會(huì)逐步解決感染性病原體鑒定的難題，進(jìn)一步推動(dòng)臨床微生物學(xué)和感染病學(xué)的發(fā)展。

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