自噬選擇性與心臟衰老的關(guān)系研究進(jìn)展

石靈，阮云軍，馮騫，蘇雙，林捷琪，楊儒于，羅昊，吳賽珠

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州 510000)

根據(jù)2016年《中國(guó)心血管病報(bào)告》，中國(guó)心血管疾病的病死率居死亡構(gòu)成首位。年齡是心血管疾病發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，年齡>50歲者缺血性心臟病的發(fā)病率逐年升高[1]。隨年齡增長(zhǎng)，心肌細(xì)胞容易出現(xiàn)損傷，損傷的細(xì)胞進(jìn)一步加重心臟的老化程度，且損傷的心肌細(xì)胞無(wú)法通過(guò)細(xì)胞增殖代償，心肌細(xì)胞依賴于細(xì)胞質(zhì)量控制以保持活力[2]。自噬是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。營(yíng)養(yǎng)充足的條件下細(xì)胞自噬功能維持在較低水平。饑餓、應(yīng)激或雷帕霉素干預(yù)可快速激活細(xì)胞的自噬功能，通過(guò)溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，提供生物合成所必須的元素、補(bǔ)充機(jī)體能量，維持細(xì)胞的生存。細(xì)胞的自噬功能隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，提示自噬與生物體的衰老有密切聯(lián)系。目前關(guān)于自噬在心肌細(xì)胞中的作用報(bào)道較少，現(xiàn)將自噬的選擇性與心臟衰老的關(guān)系相關(guān)研究綜述如下。

1 自噬選擇性

自噬是一種高度保守的降解過(guò)程，其激活涉及到多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體在不同步驟中的相互作用。自噬過(guò)程至少包括四個(gè)步驟：激活、吞噬泡的形成和延伸、胞漿內(nèi)成分的吞噬和運(yùn)輸至溶酶體進(jìn)行降解。自噬活動(dòng)受細(xì)胞內(nèi)外多種信號(hào)的共同調(diào)節(jié)，包括mTOR、Akt、AMPK、PI3K、Sirtuins、NAD+、IGF-1、Atg等。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。mTOR包括mTORC1和mTORC2兩種不同的復(fù)合體。其中，mTORC1收集廣泛的細(xì)胞信號(hào)， mTORC1被激活時(shí)對(duì)自噬進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。

當(dāng)營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)，AMPK被激活并啟動(dòng)自噬?；罨腁MPK通過(guò)磷酸化mTORC1 復(fù)合物中的Raptor亞基或激活TSC1/2蛋白來(lái)抑制mTORC1，磷酸化Ulk1形成Ulk1/Atg13/Fip200三聚體復(fù)合物，Ulk1復(fù)合物激活由核心蛋白Beclin1(Atg6)、Vps34和Vps15組成的PI3K復(fù)合物。這種復(fù)合物促進(jìn)了吞噬泡的成核。AMPK還可以通過(guò)直接激活Ulk1和下游的PI3K復(fù)合物來(lái)上調(diào)自噬。而在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)激活mTORC1來(lái)抑制自噬。Akt磷酸化并抑制TSC1/2蛋白，從而激活mTORC1。Akt也可以直接磷酸化mTORC1的一種內(nèi)源性抑制物PRAS40使其失活，進(jìn)而導(dǎo)致mTORC1的激活，自噬受到抑制。激活的mTORC1抑制Ulk1、Beclin1-VPS34-Vps15的活性，進(jìn)而下調(diào)自噬。

吞噬泡延伸形成自噬體涉及到兩種泛素樣蛋白共軛系統(tǒng)，Atg5-Atg12-Atg16L和微管結(jié)合蛋白1輕鏈3(LC3)?？扇苄缘腖C3被atg4分解成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，其產(chǎn)物L(fēng)C3Ⅱ與自噬體膜特異性融合，對(duì)吞噬泡的延伸和底物的識(shí)別起到重要作用。吞噬泡不斷延伸，將待降解的底物吞噬包裹形成自噬體。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，兩者的內(nèi)容物合為一體，運(yùn)輸?shù)牡孜镫S之被降解。

自噬降解底物最開(kāi)始被認(rèn)為是一種非選擇性的過(guò)程。最新研究發(fā)現(xiàn)自噬可以選擇目標(biāo)細(xì)菌、蛋白質(zhì)復(fù)合體和細(xì)胞器，包括過(guò)氧化物酶體、雌激素受體和線粒體來(lái)進(jìn)行降解。多數(shù)研究都著重于自噬體中的線粒體降解，即損傷的線粒體被自噬作用特異性降解，這個(gè)過(guò)程也被稱為線粒體自噬。在電子顯微鏡下觀察到成年小鼠心肌細(xì)胞中僅包含線粒體的自噬體，證實(shí)了心臟存在線粒體自噬活動(dòng)[3]。針對(duì)自噬選擇性相關(guān)的信號(hào)通路和蛋白質(zhì)的研究為特異性延緩器官老化或疾病發(fā)展指出了新的方向。

PINK1/Parkin通路通過(guò)標(biāo)記去極化的線粒體介導(dǎo)自噬。正常情況下，絲氨酸/蘇氨酸激酶PINK1進(jìn)入并定位于線粒體內(nèi)膜上，當(dāng)線粒體出現(xiàn)去極化損傷，線粒體膜電位下降時(shí)，PINK1無(wú)法進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，在線粒體外膜(OMM)上積累。PINK1介導(dǎo)線粒體融合蛋白Mfn2抗體的磷酸化，使其作為線粒體受體與Parkin相互作用[4]。Parkin在轉(zhuǎn)移到線粒體后，參與多種線粒體外膜蛋白的泛素化，底物蛋白的泛素化是自噬性降解的信號(hào)。泛素化的底物蛋白通過(guò)泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(UBA)連接自噬接頭蛋白p62/Sqstm1，再通過(guò)LIRmotif受體與LC3連接，將泛素化的底物運(yùn)送至自噬體。p62/Sqstm1在功能障礙的線粒體、折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合體的清除中起到作用。但p62/Sqstm1在PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬中并非是不可或缺的，最近的研究發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)蛋白和NDP52同樣作為重要的自噬接頭蛋白，參與線粒體自噬[5]。

線粒體自噬還可以不依賴于底物泛素化和接頭蛋白，而是直接利用線粒體上可作為自噬受體作用的蛋白質(zhì)和脂類發(fā)生。如BNIP3和NIX/ BNIP3L基因，通過(guò)LIRmotif受體直接連接吞噬泡上的LC3和γ-氨基丁酸受體相關(guān)蛋白，介導(dǎo)線粒體自噬。心磷脂和fUNDC1同樣在線粒體中可起到自噬受體的作用。Murakawa等[6]發(fā)現(xiàn)Bcl-2樣蛋白13(Bcl2-L-13)是一種線粒體自噬受體，類似于BNIP3和NIX/ BNIP3L基因，過(guò)表達(dá)的Bcl2-L-13可誘導(dǎo)線粒體自噬。另外，細(xì)胞中除線粒體外的其他細(xì)胞器諸如過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體等是否也存在類似的自噬受體，仍有待研究。

2 自噬選擇性與心臟衰老

衰老細(xì)胞中?？梢?jiàn)到受損蛋白質(zhì)和線粒體的堆積。增強(qiáng)的自噬可以抵消蛋白質(zhì)復(fù)合體和受損細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的年齡相關(guān)的積累。在不同器官抗衰老模型的研究中，均發(fā)現(xiàn)了自噬增強(qiáng)的證據(jù)。首先發(fā)現(xiàn)自噬與壽命相關(guān)的動(dòng)物模型是果蠅，增強(qiáng)的自噬延長(zhǎng)了衰老果蠅的平均壽命[7]。在哺乳動(dòng)物模型中，自噬相關(guān)蛋白Atg5全身過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠所檢查的組織，包括心臟、肺臟、骨骼肌及大腦中均可見(jiàn)自噬通量的增加，自噬增強(qiáng)的小鼠擁有更長(zhǎng)的生存期和抗衰老的表型，如胰島素敏感性的提高，體質(zhì)量下降，和運(yùn)動(dòng)機(jī)能的改善[8]。相反，自噬減少與疾病發(fā)展和壽命縮短相關(guān)。關(guān)鍵的自噬基因的功能喪失突變會(huì)導(dǎo)致黑腹果蠅的壽命短縮[7]。在小鼠中，神經(jīng)元損傷伴隨的自噬信號(hào)通路障礙會(huì)導(dǎo)致年齡相關(guān)的選擇性的神經(jīng)退行性疾病[9]，缺乏自噬接頭蛋白p62/Sqstm1的小鼠有過(guò)早衰老的表型和壽命縮短[10]。綜上所述，自噬在延緩衰老中發(fā)揮重要的作用。

目前普遍認(rèn)為自噬隨著年齡的增長(zhǎng)而減少。Russ等人報(bào)告了大鼠骨骼肌基礎(chǔ)自噬隨年齡增長(zhǎng)而減少[11]，Uddin等人在老年小鼠的胸腺和肝臟中觀察到LC3蛋白水平降低和自噬體數(shù)量減少[12]。然而，自噬水平隨年齡變化的所有研究結(jié)果并非全部一致，在衰老心臟中觀察到自噬增加、減少或不變的結(jié)果均有報(bào)道[13～15]。有研究[13]觀察到衰老小鼠的心臟有較高的Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ水平。另一項(xiàng)研究[14]發(fā)現(xiàn)，隨年齡增長(zhǎng)，心肌組織中LC3Ⅰ表達(dá)水平增加，而Beclin1和p62水平無(wú)變化，而Taneike等[15]則報(bào)道了小鼠心臟組織中LC3Ⅱ表達(dá)水平隨年齡增長(zhǎng)而減少。上述研究結(jié)果相去甚遠(yuǎn)，這可能是不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、物種和遺傳背景差異導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)誤差。但這些研究沒(méi)有直接檢測(cè)老化心臟中的自噬通量，雖然LC3Ⅱ表達(dá)水平的增加側(cè)面表明了自噬體數(shù)量的增加，但自噬體只是整個(gè)自噬過(guò)程中的一步，自噬活動(dòng)的增強(qiáng)或者自噬通量減少都可能造成自噬體數(shù)量的積累，無(wú)法僅通過(guò)自噬體數(shù)量改變說(shuō)明自噬水平的變化。同樣，LC3Ⅱ表達(dá)減少也可能是由于自噬通量增加而使自噬體降解增多，或自噬體形成數(shù)量的減少。

年齡是心血管疾病發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，隨心臟衰老可出現(xiàn)一系列并發(fā)癥如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟瓣膜鈣化、左心室肥厚、心力衰竭等。長(zhǎng)期過(guò)量的脂肪攝入抑制心臟的自噬通量，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡和心功能不全[16]。而限制能量(CR)的老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡和線粒體功能障礙的現(xiàn)象得到遏制，左室功能惡化被阻斷[17]。給予小鼠mTOR抑制劑雷帕霉素，能改善衰老心臟的線粒體蛋白質(zhì)組，并逆轉(zhuǎn)心臟功能出現(xiàn)年齡相關(guān)性下降[18]。

線粒體質(zhì)量控制是心臟抗衰老的關(guān)鍵。心肌細(xì)胞中功能障礙線粒體的積累在衰老過(guò)程和年齡相關(guān)心臟病的發(fā)展中起主要作用。細(xì)胞中的活性氧類(ROS)是線粒體呼吸的副產(chǎn)品。在正常情況下，低水平的ROS具有重要的信號(hào)功能，包括在穩(wěn)態(tài)水平下調(diào)節(jié)自噬。然而，當(dāng)線粒體出現(xiàn)功能障礙時(shí)，線粒體電子泄漏導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化，以及與ROS產(chǎn)生相關(guān)生物酶和抗氧化蛋白表達(dá)的失衡，造成ROS水平升高，過(guò)量的ROS破壞DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞器等，導(dǎo)致受損線粒體堆積，堆積的線粒體進(jìn)一步促進(jìn)了ROS生成，形成惡性循環(huán)[19]。年輕健康的心臟可以通過(guò)自噬活動(dòng)迅速清除損傷細(xì)胞器，衰老細(xì)胞中過(guò)量生成的ROS可能參與修改自噬相關(guān)調(diào)控蛋白并減少心臟的選擇性自噬，功能障礙線粒體隨自噬下降而在細(xì)胞內(nèi)累積，共同促進(jìn)心臟衰老。

Parkin基因敲除小鼠盡管在早期可以表現(xiàn)出正常的心臟表型，但隨著年齡增長(zhǎng)，這些小鼠的心肌細(xì)胞中出現(xiàn)了異常的線粒體累積[20]。盡管PINK1和Parkin基因在老化心臟中的表達(dá)水平并無(wú)變化，功能障礙線粒體對(duì)Parkin的募集明顯衰減，線粒體清除率隨之下降。老化細(xì)胞中p53的表達(dá)上調(diào)，p53與Parkin相互作用使其無(wú)法正常轉(zhuǎn)位至線粒體，自噬減少[21]。反之，心臟過(guò)度表達(dá)Parkin，提高了線粒體的周轉(zhuǎn)率并抑制心肌老化。

此外，線粒體含有獨(dú)立的基因組，編碼參與線粒體呼吸的數(shù)個(gè)亞基。線粒體DNA(mtDNA)突變隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，導(dǎo)致線粒體功能受損，積累的ROS又進(jìn)一步破壞mtDNA。隨時(shí)間推移，正常的線粒體基因組逐漸減少。Siegmund 等[22]給予mtDNA消耗綜合征模型小鼠低劑量雷帕霉素，小鼠壽命得到延長(zhǎng)。Li-Harms等[23]發(fā)現(xiàn)線粒體DNA突變的積累導(dǎo)致mTOR過(guò)度激活，抑制了POLGm/m小鼠紅系細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(MEFs)的自噬。自噬下降導(dǎo)致線粒體清除減少，功能障礙線粒體逐漸積累，細(xì)胞出現(xiàn)衰老。以上研究均表明線粒體DNA突變通過(guò)減少線粒體自噬使壽命短縮，但線粒體DNA突變?nèi)绾我餸TOR信號(hào)異常增加，線粒體DNA突變的積累如何影響老齡小鼠心臟自噬的問(wèn)題仍需解答。

心肌細(xì)胞隨年齡增長(zhǎng)積累大量的脂褐素，脂褐素主要由不可降解的交聯(lián)蛋白質(zhì)、脂類、少量碳水化合物和金屬組成，是衰老和有絲分裂后細(xì)胞的標(biāo)志。隨著年齡的增長(zhǎng)，積累的脂褐素聚合體占據(jù)溶酶體的大部分體積，影響溶酶體功能。并且，溶酶體水解酶會(huì)優(yōu)先分配給承載脂褐素的溶酶體內(nèi)，但脂褐素?zé)o法被降解，溶酶體水解酶的無(wú)效積累使能有效進(jìn)行自噬作用的酶減少，自噬通量下降，細(xì)胞功能進(jìn)一步老化。

在衰老、應(yīng)激等狀態(tài)下，線粒體內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)不能被及時(shí)降解而大量堆積，使線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，從而激發(fā)線粒體的未折疊蛋白反應(yīng)(UPRmt)，包括分子伴侶的激活和線粒體質(zhì)量控制機(jī)制[24]。給予線蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞NAD+，UPRmt通路可被強(qiáng)烈激活，并延長(zhǎng)線蟲和小鼠的壽命[25]。由此可見(jiàn)，UPRmt通路對(duì)于線粒體質(zhì)量控制的長(zhǎng)期維持非常重要，起到對(duì)抗心臟衰老和延長(zhǎng)壽命的作用。近年來(lái)關(guān)于線蟲的UPRmt通路研究炙手可熱，但對(duì)于哺乳動(dòng)物的UPRmt通路研究仍然沒(méi)有較清楚地認(rèn)識(shí)。值得注意的是，能夠誘導(dǎo)UPRmt的刺激也能夠誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，如線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈泄漏、mtDNA突變、大量錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在線粒體內(nèi)的累積等。

綜上所述，自噬通過(guò)清除細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)聚集體和功能障礙細(xì)胞器發(fā)揮有效地抗衰老作用，長(zhǎng)期熱量限制和運(yùn)動(dòng)能增加心臟的自噬作用，有利于心血管功能提升和生存期延長(zhǎng)[26]。自噬水平隨年齡增長(zhǎng)而降低。心肌細(xì)胞主要依賴于線粒體自噬保持活力，選擇性的自噬可特異性降解心肌細(xì)胞受損線粒體，改善心臟功能。衰老心肌細(xì)胞中過(guò)量生成的活性氧簇可參與修改自噬相關(guān)調(diào)控蛋白，減少心臟的選擇性自噬，自噬選擇性降低可導(dǎo)致衰老線粒體在心肌細(xì)胞內(nèi)累積，促進(jìn)心臟衰老。

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