食管鱗癌患者血清差異表達(dá)miRNAs的篩選

丁元杰，馬箐，郭旭東，沈藝，魏文強(qiáng)，劉芬

(1首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院/北京市臨床流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069；2國(guó)家癌癥中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院)

食管癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，2015年我國(guó)食管癌新發(fā)病例約47.8萬(wàn)人，病死約37.5萬(wàn)人[1]。位于太行山脈南部的河南省林州市(林縣)是我國(guó)食管癌的高發(fā)區(qū)，食管癌發(fā)病率、病死率均居全國(guó)前列，給當(dāng)?shù)卦斐闪藝?yán)重的疾病負(fù)擔(dān)[2]。我國(guó)食管癌以食管鱗癌(ESCC)為主, 其起病隱匿，早期臨床癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差。研究[3]顯示，早期食管癌治療后5年生存率可達(dá)85%，而中晚期食管癌治療后5年生存率僅有20%左右。因此，“早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療”的防治策略能有效降低食管癌的發(fā)病率和病死率。碘染色內(nèi)鏡活組織檢查是常見的食管癌確診方法，但存在感染風(fēng)險(xiǎn)高、患者依從性差等缺點(diǎn)。ESCC早期檢測(cè)血清標(biāo)志物如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)199和鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)的靈敏度或特異度較低，不能滿足臨床及人群篩查的需要[4]。因此具有高度靈敏度和特異度的新型腫瘤生物標(biāo)志物的探索是目前的研究熱點(diǎn)。小分子RNAs(microRNAs, miRNAs)是一類大小約22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，可以通過和靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR) 堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)[5, 6]。miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，表達(dá)具有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。miRNAs在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等[7]，并且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用[8]。由于miRNAs的特殊結(jié)構(gòu)，使其可以抵御RNAs酶的降解，在外周血中能夠穩(wěn)定地存在[9]。因此，了解miRNAs在外周血中的表達(dá)情況，有助于發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNAs，從而進(jìn)一步研究其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。2016年2～5月，我們通過高通量miRNAs微陣列芯片技術(shù)平臺(tái)，初步篩選林州市ESCC患者血清中差異表達(dá)的miRNAs，為進(jìn)一步在高發(fā)區(qū)人群中構(gòu)建與ESCC發(fā)病相關(guān)的miRNAs差異表達(dá)譜奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2014年10月～2015年10月河南省林州市腫瘤醫(yī)院首次經(jīng)組織病理學(xué)確診的Ⅰ期ESCC患者52例(觀察組)，其中男24例、女28例，年齡(59.0±4.1)歲，所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或其他任何相關(guān)的腫瘤治療。隨機(jī)選取同期參加食管癌早期篩查項(xiàng)目的隊(duì)列人群中性別、年齡匹配(1∶1，±5歲)的52名健康對(duì)照者(對(duì)照組)。所有納入者均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 主要試劑及儀器 miRNA提取試劑盒mirVanaTMPARISTM(Cat#AM1556，Ambion，美國(guó))，miRNA標(biāo)記和雜交試劑盒 (Agilent，美國(guó)),基因表達(dá)清洗緩沖液 (Agilent，美國(guó))，RNA 6000 Nano Kit(Agilent，美國(guó)), RNA 6000 Pico Kit(Agilent，美國(guó)), 小RNA試劑盒 (Agilent，美國(guó))等。微陣列掃描儀 (Agilent，美國(guó))，雜交艙 (Agilent，美國(guó)),雜交艙墊片 (Agilent，美國(guó)) ,雜交爐 (Agilent，美國(guó))，雜交爐轉(zhuǎn)子 (Agilent，美國(guó)) ,生化分析儀Bioanalyzer 2100 (Agilent，美國(guó))，分光光度計(jì)NanoDrop ND-2000(ThemroScientific，美國(guó))， 1.5 mL微型離心管(Eppendorf，德國(guó)), 磁力攪拌棒(Corning，美國(guó)),微型離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))等。

1.3 血清miRNAs檢測(cè) ①兩組均于清晨采集空腹外周血4 mL至血清采集管中，在室溫下靜置1 h后于低溫離心機(jī)中以4 ℃、820 g/min離心10 min；吸取約1 mL上清轉(zhuǎn)至潔凈的1.5 mL離心管中，再次離心(4 ℃，16 000 g/min)10 min，小心吸取上清到凍存管中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩＂?總RNA的提取和純化 使用mirVanaTMPARISTM試劑盒提取血清中總RNA，步驟參照試劑盒說明書。抽提所得總 RNA經(jīng)NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度及OD260/OD280，Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent，美國(guó))電泳檢測(cè)RNA完整性。兩組血清樣品的濃度及純度分析結(jié)果顯示，總RNA的總量及質(zhì)量符合miRNA微陣列的檢測(cè)要求。③ miRNA標(biāo)記和雜交 采用Agilent miRNA芯片配套的試劑盒，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程的標(biāo)記部分對(duì)樣品中的miRNA分子進(jìn)行熒光標(biāo)記。按照Agilent miRNA芯片配套提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程和配套試劑盒，進(jìn)行樣品的雜交實(shí)驗(yàn)。在滾動(dòng)雜交爐中，Hybridization Oven，55 ℃，20 rpm，滾動(dòng)雜交20 h。雜交完成后在洗缸中洗片。④ 芯片掃描及數(shù)據(jù)分析芯片結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565BA，Agilent，美國(guó))進(jìn)行掃描，用Feature Extraction software 10.7 (Agilent，美國(guó))讀取熒光信號(hào)強(qiáng)度值，軟件設(shè)置Scan resolution=5 μm, PMT 100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Gene Spring Software11.0軟件進(jìn)行歸一化處理。以hsa-miR-1228-3p的中位數(shù)為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[10]，標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P值經(jīng)過FDR校驗(yàn)。差異表達(dá)miRNAs篩選標(biāo)準(zhǔn): 信號(hào)檢測(cè)結(jié)果顯示變化方向和程度一致,ESCC患者和對(duì)照血清中的miRNAs熒光信號(hào)強(qiáng)度差異倍數(shù)(FC)的絕對(duì)值>2(代表miRNAs表達(dá)上調(diào)或下調(diào))、P< 0.05，F(xiàn)DR<0.1 。

2 結(jié)果

觀察組hsa-let-7b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1238-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-1290、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-3663-3p、hsa-miR-4281、hsa-miR-4455、hsa-miR-4516、hsa-miR-451a、hsa-miR-4532、hsa-miR-4634、hsa-miR-4687-3p、hsa-miR-4763-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-6090、hsa-miR-6515-3p、hsa-miR-92a-3p的熒光信號(hào)強(qiáng)度分別為4.661、689.033、338.070、10.635、21.280、7.940、6.791、46.552、9.745、17.944、6.714、25.561、26.300、243.228、15.900、306.905、503.306、25.997、17.814、101.998、49.293、65.336、50.498、1021.312、7.483、29.814，對(duì)照組分別為1.076、1.075、11.258、3.238、6.730、1.479、1.953、5.693、1.236、5.586、1.166、4.856、5.698、52.349、3.851、58.029、41.151、3.994、2.451、24.575、10.980、8.450、11.205、187.145、2.947、6.666。

觀察組和對(duì)照組26個(gè)miRNAs的FC分別為4.33、640.76、30.03、3.28、3.16、5.37、3.48、8.18、7.88、3.21、5.76、5.26、4.62、4.65、4.13、5.29、12.23、6.51、7.27、4.15、4.49、7.73、4.51、5.46、2.54、4.47。與對(duì)照組比較，觀察組的26個(gè)miRNAs表達(dá)水平均上調(diào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度FC絕對(duì)值均>2、P均<0.05，F(xiàn)DR均<0.1。

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，miRNAs是其中的一類。miRNAs通過與靶mRNAs的3′UTR特異性結(jié)合，降解靶mRNAs或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，從而參與到一系列的生物學(xué)進(jìn)程當(dāng)中，包括腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。目前已有許多miRNAs被發(fā)現(xiàn)與肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[11～13]。由于miRNAs是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控癌基因/抑癌基因的翻譯，癌基因/抑癌基因的激活是腫瘤發(fā)生的早期事件，因此某些特異性miRNAs有希望成為識(shí)別癌癥早期病變的標(biāo)志物。

研究表明miRNAs在不同腫瘤中通過促進(jìn)或抑制癌基因/抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。Calin等[14]發(fā)現(xiàn)在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，易于出現(xiàn)突變、丟失的染色體13ql4.3區(qū)含有miR-15和miR-16，約68%的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者有miR-15和miR-16缺失或下調(diào)，提示miR-15、miR-16與慢性淋巴細(xì)胞白血病可能存在關(guān)聯(lián)。

miRNAs作為腫瘤預(yù)警或診斷的生物標(biāo)志物具有其優(yōu)勢(shì)，相比較于傳統(tǒng)血清生物標(biāo)志物，miRNAs在血清中的表達(dá)更穩(wěn)定，反復(fù)凍融、極端pH條件等處理對(duì)其完整性影響較小[15]。其次，外周血中的miRNAs易于獲得，侵害性小，有利于在大規(guī)模的人群篩檢中應(yīng)用。miRNAs的表達(dá)具有時(shí)相性和組織特異性[16,17]，不同分化程度的細(xì)胞所產(chǎn)生的miRNAs表達(dá)譜也不盡相同，這些特性使得miRNAs有希望成為早期癌癥診斷的高效標(biāo)志物。基于芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使得我們能夠高通量的篩選外周血中差異表達(dá)的miRNAs。本研究通過高通量芯片在52對(duì)ESCC與正常對(duì)照血清中篩選出的26個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，均在ESCC患者血清中表達(dá)上調(diào)。其中，有研究報(bào)道血清hsa-miR-1246可以作為ESCC的診斷標(biāo)志物[18]，能有效區(qū)分ESCC和健康對(duì)照(靈敏度71.3%，特異度73.9%)，其表達(dá)水平與腫瘤分期相關(guān)，并可以作為腫瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[19,20]，let-7b在肺癌患者中表達(dá)下調(diào)，可能是一個(gè)腫瘤抑制基因，并且與腫瘤耐藥性相關(guān)。Vishnubalaji等[21～23]報(bào)道m(xù)iR-320c通過與SOX4、FOXM1和FOXQ1靶向結(jié)合沉默其表達(dá)，可以抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。Sromek等[24,25]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者治療前外周血中miR-16水平顯著高于健康對(duì)照，而經(jīng)過手術(shù)治療后的患者miR-16濃度恢復(fù)正常水平，提示外周血中miR-16可以作為非小細(xì)胞肺癌的生物標(biāo)志物。

以上研究結(jié)果均顯示外周血中miRNAs與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，這些miRNAs與不同腫瘤的關(guān)聯(lián)提示其可能成為腫瘤早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷的候選生物標(biāo)志物。本研究利用我國(guó)特有食管癌高發(fā)區(qū)血清樣本，初步篩選出hsa-let-7b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1238-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-1290、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-3663-3p、hsa-miR-4281、hsa-miR-4455、hsa-miR-4516、hsa-miR-451a、hsa-miR-4532、hsa-miR-4634、hsa-miR-4687-3p、hsa-miR-4763-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-6090、hsa-miR-6515-3p、hsa-miR-92a-3p 等26個(gè)差異表達(dá)的miRNAs。接下來(lái)我們將進(jìn)一步構(gòu)建特異性的miRNAs表達(dá)譜來(lái)進(jìn)行ESCC篩查或診斷，但該結(jié)果仍需要大樣本的人群實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.

[2] Wei WQ, Yang J, Zhang SW, et al. Esophageal cancer mortality trends during the last 30 years in high risk areas in China: comparison of results from national death surveys conducted in the 1970′s, 1990′s and 2004-2005[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2011, 12(7):1821-1826.

[3] Zeng H, Zheng R, Guo Y, et al. Cancer survival in China, 2003-2005: a population-based study[J]. Int J Cancer, 2015, 136(8):1921-1930.

[4] Zhai XH, Yu JK, Lin C, et al. Combining proteomics, serum biomarkers and bioinformatics to discriminate between esophageal squamous cell carcinoma and pre-cancerous lesion[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2012, 13(12):964-971.

[5] Ambros V. microRNAs: tiny regulators with great potential[J]. Cell, 2001, 107(7):823-826.

[6] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2):281-297.

[7] Ambros V. The functions of animal microRNAs[J]. Nature, 2004, 431(7006):350-355.

[8] Macfarlane LA, Murphy PR. MicroRNA: Biogenesis, Function and Role in Cancer[J]. Curr Genomics, 2010, 11(7):537-561.

[9] Garzon R, Marcucci G. Potential of microRNAs for cancer diagnostics, prognostication and therapy[J]. Curr Opin Oncol, 2012, 24(6):655-659.

[10] Hui B, Chen X, Hui L, et al. Serum miRNA expression in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncol Lett, 2015, 10(5):3008-3012.

[11] Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(8):1273-1281.

[12] 於琳，張開炯，柴利，等.原發(fā)性肝癌患者癌組織及血清miR-202表達(dá)變化及其意義[J].山東醫(yī)藥，2017,57(7)：1-4.

[13] Farahani M, Rubbi C, Liu L, et al. CLL exosomes modulate the transcriptome and behaviour of recipient stromal cells and are selectively enriched in mir-202-3p[J].PLoS One, 2015,10(10):e0141429.

[14] Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99(24):15524-155249.

[15] Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(30):10513-10518.

[16] Etheridge A, Lee I, Hood L, et al. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers[J]. Mutat Res, 2011, 717(1-2):85-90.

[17] 徐慧，郇金亮.甲狀腺乳頭狀癌組織中miRNA-106a的表達(dá)變化及其意義[J].山東醫(yī)藥，2017,57(7)：49-51.

[18] Takeshita N, Hoshino I, Mori M, et al. Serum microRNA expression profile: miR-1246 as a novel diagnostic and prognostic biomarker for oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Br J Cancer, 2013,108(3):644-652.

[19] Gong J, He L, Ma J, et al. The relationship between miR-17-5p, miR-92a, and let-7b expression with non-small cell lung cancer targeted drug resistance[J]. J Buon, 2017,22(2):454-461.

[20] Di Fazio P, Maass M, Roth S, et al. Expression of hsa-let-7b-5p, hsa-let-7f-5p, and hsa-miR-222-3p and their putative targets HMGA2 and CDKN1B in typical and atypical carcinoid tumors of the lung[J]. Tumour Biol, 2017,39(10):1010428317728417.

[21] Vishnubalaji R, Hamam R, Yue S, et al. MicroRNA-320 suppresses colorectal cancer by targeting SOX4, FOXM1, and FOXQ1[J]. Oncotarget, 2016,7(24):35789-357802.

[22] Saiselet M, Gacquer D, Spinette A, et al. New global analysis of the microRNA transcriptome of primary tumors and lymph node metastases of papillary thyroid cancer[J]. BMC Genomics, 2015,16(1):1-18.

[23] 曾薇，朱金峰，于瑞冉，等.miR-34a靶向調(diào)控Sirtuin 1表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響[J]. 山東醫(yī)藥，2017,57(24)：28-31.

[24] Sromek M, Glogowski M, Chechlinska M, et al. Changes in plasma miR-9, miR-16, miR-205 and miR-486 levels after non-small cell lung cancer resection[J]. Cell Oncol (Dordr), 2017，40(5)：529-536.

[25] Zhang X, Jiang P, Shuai L, et al. miR-589-5p inhibits MAP3K8 and suppresses CD90+cancer stem cells in hepatocellular carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016,35(1):176.