槲皮黃酮對(duì)Aβ誘導(dǎo)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究

何 標(biāo)，廉 果

0 引言

阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease，AD)是發(fā)生在老年前期及老年期的一種原發(fā)性退行性腦病，是一種持續(xù)性高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)障礙，即在沒(méi)有意識(shí)障礙的狀態(tài)下，記憶、思維、分析判斷、視空間辨認(rèn)、情緒等方面的障礙。研究顯示，在發(fā)生該病的機(jī)體腦部，存在大量激活的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，后者成簇地分布在β淀粉樣蛋白沉淀的周圍[1]，這些激活的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞高度表達(dá)多種與免疫相關(guān)的受體蛋白，分泌大量生物活性分子[2]。在阿爾茨海默癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)β淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊沉積。而小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞則可以通過(guò)吞噬作用，幫助清除Aβ斑塊沉積。但是，在病癥加重或發(fā)病后期，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放一些炎癥因子，加重炎癥反應(yīng)，造成神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷[3-5]。槲皮黃酮(Quercetin，Qu)是一種黃酮類化合物，來(lái)源于裸子植物、蕨類植物及被子植物的根莖部位[6]。近年研究表明，槲皮黃酮在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注，因其抗氧化和抗炎癥反應(yīng)的效果頗為顯著，還可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、糖尿病引起的多種并發(fā)癥及肥胖癥等[7-9]。因此，本文通過(guò)體外構(gòu)建阿爾茨海默癥細(xì)胞模型，觀察槲皮黃酮對(duì)β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2)損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

1 材料及方法

1.1 材料 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2，上海復(fù)祥生物科技有限公司)；槲皮黃酮(Sigma，CAS No.117-39-5，≥99%)；CCK8試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)；ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(巴菲爾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：131221)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海谷歌生物有限公司，批號(hào)：P0010S-01)；DMEM高糖培養(yǎng)基(武漢谷歌生物科技有限公司)；胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶(武漢谷歌生物科技有限公司)；β-actin、β-分泌酶(BACE)、早老素(PS1)、呆蛋白(NCT)、NEP、IDE一抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；二抗羊抗兔IgG購(gòu)自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 DNM-9602G型酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；單人超凈臺(tái)(蘇州華新空調(diào)凈化有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用分析儀器廠)；凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；雙色紅外激光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))。

1.3 BV-2細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng) 預(yù)先對(duì)超凈工作臺(tái)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)用品進(jìn)行紫外消毒30 min，將凍存于液氮中的BV-2細(xì)胞迅速取出，置于37 ℃溫水浴中不斷搖晃，使其在1 min內(nèi)快速溶解，離心后置于超凈工作臺(tái)上，棄去上清，加入新的DMEM完全培養(yǎng)基(10% FBS，1%雙抗)重懸細(xì)胞，分裝于3個(gè)培養(yǎng)瓶，搖勻使細(xì)胞分散均勻后，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到90%左右時(shí)，便可傳代培養(yǎng)，所有操作均在超凈工作臺(tái)上完成。取出細(xì)胞，用復(fù)溫的PBS溶液清洗細(xì)胞2遍，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓后，加入培養(yǎng)基終止消化，吸出細(xì)胞懸液于Ep管中，離心，再重懸細(xì)胞后，以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 CCK8試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸、計(jì)數(shù)后，取適量數(shù)量的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔終體積為200 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，取出棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度槲皮黃酮(10、20、40 μg/mL)的高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。棄去舊培養(yǎng)基，每孔加10 μL CCK8試劑，重新放置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，置于酶標(biāo)儀中于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.5 ELISA試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸、計(jì)數(shù)后，取適量數(shù)量的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔終體積為2 mL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，加入含低、中、高劑量槲皮黃酮(10、20、40 μg/mL)的高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清及細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)基上清用于炎癥因子IL-6、TNF-α檢測(cè)，具體操作步驟根據(jù)ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將“1.5”項(xiàng)收集的細(xì)胞用RIPA裂解液在冰上裂解，待裂解完全后，在預(yù)冷的低溫離心機(jī)中離心(12 000 r/min，12 min)，吸取上清并記錄體積，加入1/4體積的蛋白上樣緩沖液，于100 ℃煮沸7 min。并同時(shí)采用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算上樣體積。每孔上樣量為30 μg蛋白，濃縮膠采用的恒壓為70 V，分離膠采用的恒壓為120 V，離膠底部1～2 cm停止電泳。采用275 mA恒流進(jìn)行電轉(zhuǎn)，時(shí)間為90 min。采用5%脫脂奶粉封閉，將膜用TBS清洗后置于相應(yīng)盛裝抗體的盒子中，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST清洗膜3次，室溫下孵育二抗。利用Odyssey近紅外掃描儀對(duì)β-actin、BACE、PS1、NCT、NEP、IDE表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 槲皮黃酮對(duì)BV-2細(xì)胞增殖的影響 采用CCK8試劑對(duì)BV-2細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1a所示，模型組中BV-2細(xì)胞經(jīng)過(guò)Aβ刺激后，細(xì)胞的相對(duì)存活率低于正常對(duì)照組(P<0.05)。低、中、高劑量槲皮黃酮處理后，BV-2細(xì)胞的相對(duì)存活率高于模型組(P<0.05)，并且隨著槲皮黃酮?jiǎng)┝康脑黾樱鄬?duì)存活率升高越明顯，表現(xiàn)出濃度依賴性。同時(shí)，采用中劑量槲皮黃酮對(duì)細(xì)胞處理0、12、24、48、72 h，發(fā)現(xiàn)隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞相對(duì)存活率越高，見(jiàn)圖1b。

圖1 槲皮黃酮對(duì)BV-2細(xì)胞增殖的影響(n=6)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

1.正常對(duì)照組，2.模型組，3.槲皮黃酮10 μg/mL組，4.槲皮黃酮20 μg/mL組，5.槲皮黃酮40 μg/mL組

2.2 槲皮黃酮對(duì)炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平的影響 低、中、高劑量槲皮黃酮作用BV-2細(xì)胞24 h后，藥物對(duì)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6、TNF-α水平的影響如圖2所示。模型組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-6、TNF-α的含量高于正常對(duì)照組(P<0.05)。經(jīng)過(guò)不同劑量槲皮黃酮處理后，細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α的表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)；隨著槲皮黃酮?jiǎng)┝康纳撸琁L-6、TNF-α含量的下降越明顯，表現(xiàn)出濃度依賴性。

2.3 槲皮黃酮對(duì)BACE、PS1、NCT、蛋白表達(dá)水平的影響 采用Western blot檢測(cè)BV-2細(xì)胞中BACE、PS1、NCT蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖3。模型組細(xì)胞BACE、PS1、NCT蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P<0.05)。低、中、高劑量槲皮黃酮組BACE、PS1、NCT蛋白表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)，并且隨著藥物濃度增加，其蛋白表達(dá)水平降低越明顯，表現(xiàn)出濃度依賴性。

2.4 槲皮黃酮對(duì)腦啡肽酶(NEP)、胰島素降解酶(IDE)表達(dá)水平的影響 采用免疫印跡技術(shù)對(duì)BV-2細(xì)胞中NEP及IDE蛋白檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，模型組細(xì)胞經(jīng)過(guò)Aβ刺激后，NEP及IDE蛋白表達(dá)水平相對(duì)于正常對(duì)照組而言顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而經(jīng)過(guò)低、中、高劑量槲皮黃酮處理后，NEP及IDE蛋白表達(dá)水平相對(duì)于Aβ刺激組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著藥物濃度增加顯著性越明顯，表現(xiàn)出濃度依賴性。

圖2 槲皮黃酮對(duì)BV-2細(xì)胞分泌炎癥因子的影響(n=6)

圖3 槲皮黃酮對(duì)BACE、PS1及NCT蛋白表達(dá)水平的影響(n=6)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

1.正常對(duì)照組，2.模型組，3.槲皮黃酮10 μg/mL組，4.槲皮黃酮20 μg/mL組，5.槲皮黃酮40 μg/mL組

圖4 槲皮黃酮對(duì)NEP及IDE蛋白表達(dá)水平的影響(n=6)

3 討論

BV-2細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有免疫活性的巨噬樣細(xì)胞，其聚集在β淀粉樣蛋白斑塊周圍，這些活化的BV-2細(xì)胞能夠過(guò)度表達(dá)多種與免疫相關(guān)的受體蛋白，參與阿爾茨海默癥的發(fā)生、發(fā)展[10]。有報(bào)道，TNF-α對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞及小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用，其能夠增強(qiáng)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能，分泌前炎癥細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子，影響神經(jīng)元膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，并可以協(xié)調(diào)IL-1誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生[11]。IL-6是一種具有破壞性的前炎癥細(xì)胞因子，可以介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫及炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞功能異常。細(xì)胞內(nèi)β淀粉樣蛋白的沉積及小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)均是阿爾茨海默癥的發(fā)病機(jī)制[12]，因此，減少小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積及炎癥反應(yīng)，可能是治療阿爾茨海默癥的一種方式。

采用Aβ誘導(dǎo)可較好地構(gòu)建BV-2細(xì)胞損傷模型，經(jīng)過(guò)低、中、高3種劑量的槲皮黃酮處理后，BV-2細(xì)胞的相對(duì)存活率相對(duì)于Aβ誘導(dǎo)模型組顯著增加。藥物處理后，可明顯降低炎癥因子IL-6及TNF-α的表達(dá)水平。并且槲皮黃酮可以明顯降低BACE、PS1及NCT蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明槲皮黃酮可以抑制Aβ合成酶的表達(dá)及與老年癡呆相關(guān)蛋白的表達(dá)；同時(shí)，槲皮黃酮還可以促進(jìn)Aβ消化酶NEP及IDE的表達(dá)，說(shuō)明槲皮黃酮可以促使Aβ降解，減少其在小神經(jīng)膠質(zhì)中的沉積。

綜上所述，槲皮黃酮對(duì)Aβ誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用的機(jī)制可能與抑制Aβ分泌酶表達(dá)和激活A(yù)β消化酶表達(dá)相關(guān)。

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