斜臥青霉轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Hac1染色質(zhì)免疫共沉淀分析方法的建立

房艷華，韋小敏，李 肖，來航線，馬小娟(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)技術(shù)是在生理狀態(tài)下將細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲波或酶處理將染色質(zhì)切為小片段(100～1 000 bp最佳)，用交聯(lián)蛋白的特異性抗體沉淀交聯(lián)物，從而將與目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段沉淀下來的一種技術(shù)。人們通過對(duì)目的DNA片段的純化和檢測(cè)，獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息[1]。因此，染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)是研究DNA-蛋白質(zhì)體內(nèi)瞬時(shí)相互作用的常用方法之一[2-3]，可以用來研究轉(zhuǎn)錄因子和靶基因啟動(dòng)子區(qū)域在體內(nèi)的相互作用，從而確定它們之間相互作用方式的動(dòng)態(tài)變化[4-6]，是揭示基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的重要手段。近年來，此技術(shù)經(jīng)過不斷的發(fā)展和完善，特別是與DNA芯片和分子克隆技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)應(yīng)用于高通量篩選已知蛋白因子的未知DNA靶點(diǎn)和反式作用因子在整個(gè)基因組上分布情況[7-10]的研究。

CHIP技術(shù)自問世以來，在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用[11-12]，如在釀酒酵母上成功找到了組蛋白H4的結(jié)合區(qū)域[13]，在煙曲霉上成功發(fā)現(xiàn)了固醇轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白SrbA在真菌缺氧和毒性反應(yīng)條件下的新調(diào)控機(jī)制[14]，然而在斜臥青霉菌上尚未見相關(guān)報(bào)道。Hac1是斜臥青霉調(diào)控蛋白分泌的重要因子，運(yùn)用CHIP技術(shù)研究斜臥青霉轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Hac1的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示蛋白分泌的深層機(jī)理，提高蛋白分泌能力。為此，本研究以斜臥青霉轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Hac1為研究對(duì)象(交聯(lián)蛋白)，對(duì)CHIP操作過程中的交聯(lián)時(shí)間、菌絲用量及超聲破碎條件(功率、超聲時(shí)間、間隔時(shí)間、超聲次數(shù))等進(jìn)行優(yōu)化，分析CHIP技術(shù)在斜臥青霉上應(yīng)用的可能性，以期找出Hac1調(diào)控的靶基因。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 斜臥青霉菌株114-2由山東大學(xué)提供。

1.1.2 試劑及儀器 二硫蘇糖醇(DTT)、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和RNA酶，購自上海生工生物工程公司；真菌蛋白酶抑制劑，購自Sigma公司。QIAquick PCR purification kit試劑盒(QIAGEN)，超聲波破碎儀(新芝，JY92- IIN)，核酸測(cè)定儀(BioTek Epoch)。

Mandel’s營養(yǎng)鹽：KH2PO43 g/L，NaNO32.6 g/L，尿素0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5 mg/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 3.6 mg/L，CoCl2·6H2O 3.7 mg/L，MgSO4.7H2O 0.5 g/L，CaCl20.5 g/L，蛋白胨1 g/L，pH約5.5。葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Mandel’s營養(yǎng)鹽+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%葡萄糖。麩皮-微晶纖維素培養(yǎng)基：Mandel’s營養(yǎng)鹽+質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%麩皮+質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%微晶纖維素。

交聯(lián)Buffer：0.4 mol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，使用前添加1 mmol/L PMSF和體積分?jǐn)?shù)1%的甲醛。CHIP緩沖液：50 mmol/L HEPES (pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，體積分?jǐn)?shù)1% TritonX-100，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%脫氧膽酸鹽，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS，1 mmol/L PMSF，1×真菌蛋白酶抑制劑。低鹽緩沖液：150 mmol/L NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS，體積分?jǐn)?shù)1% TritonX-100，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。高鹽緩沖液：500 mmol/L NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS，體積分?jǐn)?shù)1% TritonX-100，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。LiCl緩沖液：0.25 mol/L LiCl，體積分?jǐn)?shù)1% NP40，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%脫氧膽酸鈉，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。

1.2 CHIP關(guān)鍵條件的優(yōu)化

1.2.1 菌絲體制備 用50 mL葡萄糖液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)斜臥青霉48 h后，抽濾收集菌絲體，稱取約500 mg菌絲體轉(zhuǎn)接到50 mL麩皮-微晶纖維素液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)7 h后，加入終濃度為10 mmol/L的DTT誘導(dǎo)Hacl表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，真空抽濾收集菌絲體，無菌ddH2O沖洗2次備用。

1.2.2 交聯(lián)時(shí)間的優(yōu)化 取真空抽濾收集的菌絲放入無菌的250 mL錐形瓶中，加入50 mL交聯(lián)Buffer，30 ℃、100 r/min輕搖，使DNA和目的蛋白(Hac1)充分交聯(lián)，交聯(lián)時(shí)間分別設(shè)置為5，10，20，30 和40 min，交聯(lián)結(jié)束后加入2.5 mL 2 mol/L的甘氨酸終止反應(yīng)，然后繼續(xù)搖動(dòng)溫育10 min。交聯(lián)菌絲真空過濾器抽干，無菌ddH2O沖洗后，立即用液氮速凍后于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.3 超聲波破碎菌絲用量的優(yōu)化 用液氮將冷凍菌絲快速研磨成粉末，分別取0.25，0.50，1.00和1.50 g菌絲粉末轉(zhuǎn)移到裝有10 mL CHIP緩沖液的50 mL離心管中，渦旋混勻，取500 μL樣品置于1.5 mL離心管中，以備超聲波破碎使用。

1.2.4 DNA超聲波破碎條件的優(yōu)化 取適量經(jīng)液氮冷凍研磨的菌絲粉末置于裝有10 mL CHIP緩沖液的50 mL離心管中，渦旋混勻后分成多份，每份500 μL，置于1.5 mL離心管中進(jìn)行超聲波破碎，對(duì)超聲功率、超聲時(shí)間、間隔時(shí)間和超聲次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)中超聲功率設(shè)置為15 W(6%)，20 W(8%)，25 W(10%)和30 W(12%)；超聲時(shí)間設(shè)置為1，3和5 s；超聲間隔時(shí)間設(shè)置為10，20，30和40 s；超聲次數(shù)設(shè)置為15，25，30和40次。在對(duì)某一條件優(yōu)化時(shí)固定其他3個(gè)條件不變，本試驗(yàn)各條件的固定值為超聲功率25 W(10%)，超聲工作時(shí)間 5 s，間隔時(shí)間40 s，超聲30次。

樣品經(jīng)超聲破碎儀超聲打斷后，于4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min，取400 μL上清液平均分裝到2個(gè)新的離心管中，一管用于解交聯(lián)染色體檢驗(yàn)，另一管用于CHIP試驗(yàn)。

1.2.5 解交聯(lián)染色體的檢驗(yàn) 分別取200 μL超聲樣品和1.2.2節(jié)的交聯(lián)樣品，加入8 μL 5 mol/L NaCl，65 ℃溫育6 h或過夜后，使交聯(lián)的DNA和Hac1蛋白質(zhì)解交聯(lián)[14]，然后用抽提緩沖液(V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1)抽提1次，再用氯仿抽提。向抽提液中加入20 μg糖原和1 mL無水乙醇沉淀DNA 1 h，4 ℃下13 000 r/min 離心10 min，乙醇揮發(fā)后加入30 μL 1×TE溶解DNA，最后加入1 μL RNA酶(10 mg/mL)，并在37 ℃下溫育30 min。對(duì)上述樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)樣品的超聲效果，從而確定各條件的優(yōu)化結(jié)果。

1.3 CHIP試驗(yàn)

以優(yōu)化的條件對(duì)菌絲進(jìn)行處理，獲得合格的DNA片段，進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)。

1.3.1 磁珠的清洗 為防止蛋白A/G瓊脂糖磁珠受損，每份超聲樣品用去尖端的槍頭吸取120 μL 蛋白A/G瓊脂糖磁珠分裝于2個(gè)1.5 mL的離心管中，用500 μL CHIP緩沖液沖洗2次， 4 ℃下1 000 r/min 離心1 min后收集磁珠。

1.3.2 樣品的預(yù)處理 將1.2.3節(jié)的超聲樣品加入到蛋白A/G瓊脂糖磁珠中，于 4 ℃冷室緩慢搖晃孵育1 h，將樣品中可以結(jié)合蛋白A/G瓊脂糖磁珠的物質(zhì)去除，防止非特異性結(jié)合，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。將樣品于4 ℃下10 000 r/min離心2 min，取上清，用于下一步試驗(yàn)。

1.3.3 抗原抗體的結(jié)合 將預(yù)處理后的樣品分為2組，一組加入10 μg親和純化抗體(轉(zhuǎn)錄因子Hac1特異性抗體)，標(biāo)記為試驗(yàn)組；一組不加抗體，作為陰性對(duì)照組。所有處理同時(shí)置于4 ℃冷室，緩慢搖晃孵育過夜。在孵育過程中，抗體會(huì)特異性地與交聯(lián)了目的DNA片段的抗原蛋白結(jié)合。

1.3.4 抗體磁珠吸附 將75 μL用CHIP緩沖液預(yù)處理過的蛋白A/G瓊脂糖磁珠分別加入上述2組樣品中，4 ℃冷室緩慢搖晃4 h，使蛋白A/G瓊脂糖磁珠特異性地與抗體結(jié)合。然后于4 ℃下1 000 r/min離心1 min，使蛋白A/G瓊脂糖磁珠結(jié)合的抗體、抗原蛋白和交聯(lián)的DNA共同沉淀，小心棄上清，保留沉淀。

1.3.5 沉淀的清洗 為去除非特異性結(jié)合，向上述沉淀中依次加入1 mL下述清洗緩沖液，緩慢搖晃5 min，4 ℃下 1 000 r/min離心1 min，棄上清。清洗時(shí)所用緩沖液依次為：低鹽緩沖液(清洗1次)，高鹽緩沖液(清洗1次)， LiCl緩沖液(清洗1次)， TE緩沖液(1 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，清洗2次)。

1.4 解交聯(lián)

收集1.3節(jié)所得清洗后的沉淀，加入100 μL新配制的Elution緩沖液洗脫，搖晃混勻，65 ℃溫育10 min，1 000 r/min離心1 min，將上清液小心轉(zhuǎn)移到一支新的1.5 mL離心管中，沉淀繼續(xù)加入100 μL Elution緩沖液進(jìn)行第2次洗脫。2次洗脫后所得上清液共200 μL。所有樣品加入8 μL 5 mol/L NaCl溶液，65 ℃靜置6～8 h，使交聯(lián)的蛋白和DNA解交聯(lián)。

1.5 DNA純化及檢測(cè)

在解交聯(lián)溶液中加入1 μL 10 mg/mL的RNA酶于37 ℃溫育30 min，以去除溶液中殘留的RNA。然后按照QIAquick PCR purification kit試劑盒說明書純化DNA，純化后的DNA用30 μL EB緩沖液溶解。用BioTek Epoch核酸測(cè)定儀檢測(cè)純化的DNA濃度。以純化后的DNA為模板，以隨機(jī)引物1(5′-GGTGACGCAG-3′)和2(5′-CTCTCCGCCA-3′)進(jìn)行PCR檢測(cè)，試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置不加抗體的處理作為陰性對(duì)照，引物由上海生工生物公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板DNA 1 μL，Taq酶 (5 U/μL) 0.5 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP (10 mmol/L) 2.0 μL，引物1或2 (10 mmol/L)1.5 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃變性1 min，32～34 ℃退火l min，72 ℃延伸1.5 min，40次循環(huán)；72 ℃充分延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜臥青霉CHIP試驗(yàn)交聯(lián)時(shí)間的優(yōu)化

DNA與蛋白質(zhì)有效交聯(lián)是染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)的關(guān)鍵一步，本研究中超聲破碎染色質(zhì)片段和直接解交聯(lián)所得DNA的電泳結(jié)果見圖1。

A.交聯(lián)樣品經(jīng)超聲打斷后解交聯(lián)產(chǎn)物的電泳結(jié)果;B.交聯(lián)樣品直接解交聯(lián)產(chǎn)物的電泳結(jié)果;1～5.交聯(lián)時(shí)間分別為5,30,10,20,40 min;M.DNA MarkerA.Cross-linked sample by reverse crosslinking after ultrasonic interruption;B.Cross-linked sample by reverse crosslinking directly;1-5.Crosslinking times were 5,30,10,20,and 40 min;M.DNA Marker圖1 斜臥青霉Hac1 CHIP試驗(yàn)交聯(lián)時(shí)間的優(yōu)化Fig.1 Optimization of crosslinking time for ultra-sonication used in CHIP in Penicillium decumbens

圖1-A顯示，交聯(lián)時(shí)間明顯影響超聲破碎DNA的效果，交聯(lián)時(shí)間在5～20 min時(shí)DNA都能被打斷，但交聯(lián)時(shí)間≥30 min時(shí)DNA很難被打斷。圖1-B顯示，交聯(lián)時(shí)間在5～20 min時(shí)，直接解交聯(lián)處理的樣品總DNA能被提取出來，而交聯(lián)時(shí)間≥30 min時(shí)直接解交聯(lián)的DNA很難被提取。結(jié)果表明，隨著交聯(lián)時(shí)間的延長，DNA與蛋白結(jié)合得越緊密，很難超聲打斷及解交聯(lián)，所以交聯(lián)時(shí)間應(yīng)控制在20 min以內(nèi)。

2.2 斜臥青霉CHIP試驗(yàn)菌絲用量的優(yōu)化

試驗(yàn)中，由于10 mL CHIP緩沖液中加入1.50 g菌絲時(shí)，菌懸液濃度過高，超聲過程中產(chǎn)生泡沫，造成空打，不能充分打斷DNA，因此無法進(jìn)行后續(xù)研究；由圖2可見，10 mL CHIP緩沖液中加入0.25或0.50 g菌絲時(shí)，超聲打斷后的電泳條帶不夠亮，DNA含量不高；加入1.00 g菌絲時(shí)，超聲可正常進(jìn)行且條帶較亮。因此為了保證后續(xù)共沉淀中DNA量足夠，本試驗(yàn)10 mL CHIP緩沖液中的菌絲用量以1.00 g為宜。

2.3 斜臥青霉CHIP試驗(yàn)超聲波破碎條件的優(yōu)化

2.3.1 超聲功率 圖3結(jié)果表明，當(dāng)超聲功率為15 W(6%)和20 W(8%)時(shí)，超聲打斷的DNA片段比較分散，部分片段長度達(dá)1 000 bp以上，不適合進(jìn)行后續(xù)CHIP試驗(yàn)；當(dāng)超聲功率提高到25 W(10%)時(shí)，超聲打斷的DNA片段大部分長度集中在100～800 bp，可滿足后續(xù)試驗(yàn)要求；超聲功率達(dá)30 W(12%)時(shí)，DNA片段長度也集中在100～800 bp，與功率為25 W(10%)時(shí)的效果相差不大，綜合考慮選擇25 W(10%)的超聲功率。

2.3.2 超聲工作時(shí)間及間隔時(shí)間 圖4表明，保持超聲功率25 W(10%)、超聲30次不變的情況下，改變超聲工作時(shí)間和間隔時(shí)間，超聲打斷DNA的效率不同。由圖4-A可知，隨著超聲工作時(shí)間的延長，DNA片段長度變小，當(dāng)超聲工作時(shí)間為5 s時(shí)，大部分DNA片段長度在1 000 bp以下，已基本符合CHIP試驗(yàn)要求。由圖4-B可知，隨著間隔時(shí)間的延長，DNA片段趨于集中，其中當(dāng)間隔時(shí)間為30 s時(shí)，DNA片段長度在100～1 000 bp；當(dāng)間隔時(shí)間為40 s時(shí)，DNA片段長度在100～800 bp，符合染色質(zhì)免疫共沉淀要求。因此為保證后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行，選擇超聲工作時(shí)間為5 s，間隔40 s。

1～3.菌絲添加量分別為0.25,0.50,1.00 g;M.DNA Marker1-3.The dosages of hyphae were 0.25,0.50,1.00 g；M.DNA Marker圖2 斜臥青霉Hac1 CHIP試驗(yàn)菌絲用量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of hyphae dosage for ultra-sonication used in CHIP in Penicillium decumbens1～4.超聲功率分別為15,20,25和30 W;M.DNA Marker1-4.Ultrasonic power was 15,20,25 and 30 W;M.DNA Marker圖3 斜臥青霉Hac1 CHIP試驗(yàn)超聲波破碎功率的優(yōu)化Fig.3 Optimization of ultrasonic power used in CHIP in Penicillium decumbens

1～3.超聲時(shí)間分別為1,3,5 s;4～7.間隔時(shí)間分別為10,20,30,40 s;M.DNA Marker1-3.Ultrasonic times were 1,3,and 5 s;4-7.Interval times were 10,20,30,and 40 s;M.DNA Marker圖4 斜臥青霉Hac1 CHIP試驗(yàn)超聲波破碎工作時(shí)間(A)及間隔時(shí)間(B)的優(yōu)化Fig.4 Optimization of ultrasonic work time and interval time used in CHIP in Penicillium decumbens

2.3.3 超聲次數(shù)的確定 圖5結(jié)果表明，隨著超聲次數(shù)增加，DNA片段逐漸變小，當(dāng)超聲次數(shù)為15和25次時(shí)，得到的大部分DNA片段長度在500～1 000 bp，片段較大；當(dāng)超聲次數(shù)為30次時(shí)，DNA片段長度主要集中在100～750 bp，符合后續(xù)試驗(yàn)要求；當(dāng)超聲次數(shù)達(dá)到40次時(shí)，大部分DNA片段長度在500 bp以下，片段過小。因此,確定超聲次數(shù)以30次為宜。

2.4 CHIP試驗(yàn)所得DNA的PCR檢測(cè)

樣品經(jīng)抗原抗體結(jié)合、磁珠吸附、解交聯(lián)等步驟獲得DNA，用QIAquick PCR purification kit試劑盒純化后，進(jìn)行DNA濃度測(cè)定和隨機(jī)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，試驗(yàn)組純化后測(cè)得DNA濃度為10.44 ng/μL。以此DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在500～750 bp間可見明顯的擴(kuò)增條帶(圖6)，說明成功富集到了轉(zhuǎn)錄因子Hac1特異性結(jié)合的DNA片段。

1～4.超聲次數(shù)分別為15,25,30,40次;M.DNA Marker1-4.Ultrasonic frequencies were 15,25,30,and 40 times;M.DNA Marker圖5 斜臥青霉Hac1 CHIP試驗(yàn)超聲波破碎次數(shù)的優(yōu)化Fig.5 Optimization of ultrasonic frequency used in CHIP in Penicillium decumbens1～2.分別為陰性對(duì)照組隨機(jī)引物1和2擴(kuò)增產(chǎn)物；3～4.分別為試驗(yàn)組隨機(jī)引物1和2擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DNA Marker1-2.The control group results of PCR amplification using random primer 1 and primer 2;3-4.The experimental group results of PCR amplification using random primer 1 and primer 2；M.DNA Marker圖6 斜臥青霉Hac1 CHIP試驗(yàn)所獲DNA的PCR檢驗(yàn)結(jié)果Fig.6 PCR amplification of DNA collected by CHIP in Penicillium decumbens

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)是一類很重要的蛋白質(zhì)分子，其可以通過靶定調(diào)控一些下游效應(yīng)分子，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮強(qiáng)大的生物學(xué)作用[15]。近年來，染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，利用此項(xiàng)技術(shù)找出轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，從而揭示轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制，受到了研究者的關(guān)注。

Grably等[13]以釀酒酵母為材料，首先破碎細(xì)胞提取細(xì)胞核，然后進(jìn)行細(xì)胞核超聲破碎，獲得合適的染色質(zhì)片段；本研究參照Chung等[14]的方法將交聯(lián)菌絲液氮研磨處理后，直接超聲打斷，省去了提核的步驟。Baranello等[16]的研究表明，交聯(lián)時(shí)間對(duì)染色質(zhì)免疫共沉淀的后續(xù)步驟影響較大，交聯(lián)時(shí)間過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以超聲破碎，影響結(jié)果，而且試驗(yàn)材料也容易在離心過程中丟失；交聯(lián)時(shí)間過短，則交聯(lián)不完全，容易產(chǎn)生假陰性反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間≥20 min時(shí)，交聯(lián)的DNA和蛋白質(zhì)不能被充分解交聯(lián)，而且不能被超聲打斷，所以交聯(lián)時(shí)間需控制在20 min以內(nèi)。在染色質(zhì)免疫共沉淀過程中，超聲破碎染色質(zhì)的程度對(duì)于整個(gè)試驗(yàn)的成功至關(guān)重要，超聲不徹底會(huì)引起染色質(zhì)蛋白復(fù)合物過大，抗體不易富集；超聲過度則會(huì)引起蛋白降解或蛋白抗原表位被破壞，影響富集[17]。一般認(rèn)為染色質(zhì)被超聲打碎成100～1 000 bp的片段最好[18]。本試驗(yàn)最終確定，超聲破碎功率25 W(10%)、超聲工作時(shí)間5 s、間隔40 s、超聲30次為最適合斜臥青霉染色質(zhì)破碎的條件。影響超聲波破碎效率的另外一個(gè)重要因素是超聲打斷染色體的量，染色體量太小，特異性抗原與抗體結(jié)合的概率較小，染色質(zhì)免疫共沉淀效率降低；染色體量太大，超聲打斷時(shí)由于液體中染色體濃度太大，超聲過程中容易起沫，泡沫飛濺易造成空打且會(huì)造成超聲破碎儀的損壞，也會(huì)影響破碎效率。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲破碎的最佳菌絲用量為10 mL CHIP緩沖液中加入1.00 g菌絲。本研究通過對(duì)交聯(lián)時(shí)間、超聲條件、菌絲用量等條件的優(yōu)化，成功富集到轉(zhuǎn)錄因子Hac1結(jié)合的特異性DNA序列，為Hac1的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。相較于以往對(duì)超聲波破碎條件的相關(guān)研究，本研究對(duì)斜臥青霉超聲波破碎的條件進(jìn)行了系統(tǒng)而全面的研究，避免因超聲產(chǎn)物不合格而浪費(fèi)昂貴的抗體，同時(shí)也為研究其他絲狀真菌轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制提供了思路。

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