研磨法與凍融法測(cè)定湖庫(kù)葉綠素a的方法探討

(河北省滄州水文水資源勘測(cè)局,河北 滄州 061000)

葉綠素a含量是評(píng)價(jià)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化程度的重要參數(shù)之一。因此，探討其檢測(cè)分析方法的實(shí)用性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文對(duì)研磨法與反復(fù)凍融法測(cè)定大浪淀水庫(kù)中葉綠素a的含量進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果表明：反復(fù)凍融法是最佳的分析方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 水樣采集

水樣來(lái)自河北省滄州市大浪淀水庫(kù)。大浪淀水庫(kù)于1997年建成，是河北省第一座平原水庫(kù)，屬大(2)型，總投資2.8億元，蓄水面積16.738km2，設(shè)計(jì)總庫(kù)容1.003億m3，每年可向市區(qū)供水8121萬(wàn)m3，是滄州市居民用水的主要水源地。

1.2 主要試劑

90%丙酮溶液、1%碳酸鎂懸濁液。

1.3 儀器和設(shè)備

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫冰箱、離心機(jī)、抽濾裝置、研缽、微孔濾膜、培養(yǎng)皿、具塞玻璃離心管。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將一定量水樣用玻璃纖維膜過(guò)濾，收集藻類，分別使用研磨法和反復(fù)凍融法對(duì)藻類細(xì)胞進(jìn)行破碎，用90%的丙酮溶液提取葉綠素，根據(jù)葉綠素光譜特征依次測(cè)定750nm、664nm、 647nm、 630nm波長(zhǎng)下的吸光度，計(jì)算葉綠素a的含量。

1.5 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

此次操作設(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)。一組實(shí)驗(yàn)是由同一檢測(cè)人員分析同一樣品的多個(gè)平行樣，且樣品的取樣體積均相等,檢驗(yàn)研磨法和反復(fù)凍融法的重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表1。另一組實(shí)驗(yàn)是由不同的檢測(cè)人員用不同的提取方法測(cè)定葉綠素a，檢驗(yàn)不同檢測(cè)人員分析結(jié)果的精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 研磨法和反復(fù)凍融法比對(duì)測(cè)定結(jié)果 單位：μg/L

2 實(shí)驗(yàn)分析與討論

2.1 兩種方法對(duì)比試驗(yàn)

兩種方法結(jié)果比對(duì)分析，表明兩種提取方法有顯著性差異，反復(fù)凍融法的方差明顯低于研磨法。由標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出，反復(fù)凍融法和研磨法的平行樣品之間差異顯著性不大，反復(fù)凍融法實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性高于研磨法，反復(fù)凍融法避免了研磨法因多次轉(zhuǎn)移樣品帶來(lái)的操作誤差。

表2 不同檢測(cè)人員研磨法和反復(fù)凍融法測(cè)定結(jié)果比對(duì) 單位：μg/L

由表2可以看出，研磨法測(cè)定樣品的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差相差較大，而反復(fù)凍融法測(cè)定樣品的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差相差不大。這說(shuō)明對(duì)于不同的檢測(cè)人員利用研磨法測(cè)定樣品，測(cè)定結(jié)果差異較大；而不同的檢測(cè)人員利用反復(fù)凍融法測(cè)定樣品，測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。實(shí)驗(yàn)證明：采用反復(fù)凍融法，只要檢測(cè)人員按照實(shí)驗(yàn)要求去做，就不會(huì)因?yàn)闄z測(cè)人員不同而影響測(cè)定結(jié)果，而利用研磨法，檢測(cè)人員研磨時(shí)的力度、方法、轉(zhuǎn)移樣品是否完全都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。因此，反復(fù)凍融法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有因?yàn)闄z測(cè)人員的更換而出現(xiàn)大幅度的波動(dòng)，精確度高。兩種方法結(jié)果比對(duì)分析，表明:兩種提取方法有顯著性差異，反復(fù)凍融法的方差明顯低于研磨法。由標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出，反復(fù)凍融法和研磨法的平行樣品之間差異顯著性不大，反復(fù)凍融法實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性高于研磨法，反復(fù)凍融法避免了研磨法因多次轉(zhuǎn)移樣品帶來(lái)的操作誤差。

2.2 破碎液的顯微觀察

葉綠素a含量的測(cè)定，關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于能否將葉綠素從細(xì)胞中有效提取出來(lái)，多次冷熱交替的反復(fù)凍融法，提高了細(xì)胞的破碎率。在觀察細(xì)胞破碎的實(shí)驗(yàn)中，為了便于觀察和計(jì)數(shù)，采用了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的柵藻，稀釋到一定濃度，進(jìn)行凍融和研磨，在顯微鏡下觀察破碎情況，計(jì)算破碎率，結(jié)果表明反復(fù)凍融法的破碎率在90%以上，而研磨法的破碎率僅為50%～60%。

3 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用的玻璃器皿和比色皿均應(yīng)清潔、干燥，但不要用酸浸泡和洗滌。分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的A級(jí)玻璃量器，分析純?cè)噭┖图兯?。整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在暗處進(jìn)行，因?yàn)槿~綠素提取液對(duì)光非常敏感，極易發(fā)生光和作用。有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：樣品置于暗處，24h內(nèi)基本不分解，弱光條件下，1h內(nèi)基本不分解，光照條件下會(huì)很快分解，因此，提取后的樣品應(yīng)盡快測(cè)定，提取操作等應(yīng)在低溫、暗處進(jìn)行。

4 試驗(yàn)結(jié)果分析與討論

a.根據(jù)實(shí)驗(yàn)比對(duì)，反復(fù)凍融法的相對(duì)偏差遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于研磨法的相對(duì)偏差，說(shuō)明反復(fù)凍融法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)大幅波動(dòng)，精確度高，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)只要掌握好凍融的時(shí)間和室溫，細(xì)胞的破碎程度也不會(huì)因?yàn)闄z測(cè)人員的不同而有明顯變化。而研磨法的細(xì)胞破碎程度與檢測(cè)人員有很大關(guān)系，由于檢測(cè)人員研磨時(shí)的力度、方法均有差異，因而，使用研磨法，檢測(cè)人員不同，細(xì)胞的破碎程度會(huì)有明顯差異。同時(shí)隨著研磨時(shí)間延長(zhǎng)，樣品暴露在自然陽(yáng)光下的時(shí)間增加，葉綠素的破壞程度會(huì)有所加大。

b.反復(fù)凍融和研磨兩種方法在測(cè)定所需的時(shí)間上無(wú)明顯差異，但是反復(fù)凍融法減少了檢測(cè)人員接觸丙酮的時(shí)間和次數(shù)，保護(hù)了檢測(cè)人員的身體健康，同時(shí)反復(fù)凍融法所需要的儀器少，故適合大批量的樣品分析。

c.反復(fù)凍融法操作簡(jiǎn)單，減少了樣品的轉(zhuǎn)移次數(shù)，降低了樣品的損失，同時(shí)提高了細(xì)胞的破碎率，避免了研磨不完全而帶來(lái)的人為誤差，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精確性。

d.在處理大批量的樣品時(shí)，反復(fù)凍融法所需的實(shí)驗(yàn)器材遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于研磨法，大大提高了工作效率。

e.對(duì)葉綠素a測(cè)定值的評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：用反復(fù)凍融法處理水樣具有安全、高效的特性,750nm 處吸光度值容易達(dá)到0.005。

5 結(jié) 語(yǔ)

反復(fù)凍融法所需儀器設(shè)備少，操作簡(jiǎn)便，減少污染，準(zhǔn)確度高，適用于大批量樣品檢測(cè)，因此反復(fù)凍融法測(cè)定葉綠素a具有一定的實(shí)用價(jià)值。

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