慢性阻塞性肺病大鼠血漿白三烯C4水平、細胞免疫及支氣管上皮多藥耐藥相關(guān)蛋白1 mRNA和蛋白水平的變化

黃燕玲 羅光偉 毛莉娜

(武漢市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是中老年人的常見病和多發(fā)病，許多患者最終因呼吸衰竭或慢性肺源性心臟病而死亡〔1～3〕。白三烯(LT)C4是和谷胱甘肽共軛的炎癥產(chǎn)物，與COPD 患者的支氣管黏膜炎癥、支氣管平滑肌收縮和氣道重構(gòu)的關(guān)聯(lián)仍未清晰闡明〔4〕；另外多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)1與LTC4有較高親和力〔5〕。本研究探討COPD大鼠血漿LTC4、T淋巴細胞亞群和支氣管上皮MRP1 mRNA表達與COPD的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，體重180～220 g，購于武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(鄂)2003-0004。隨機分為模型組和正常對照組各10只。

1.2COPD模型制備 于大鼠氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)加熏香煙方法制備COPD模型。在第1天和第14天，將大鼠全麻，于氣道注入溶于生理鹽水的LPS 200 μl(1 mg/ml)，正常對照組注入生理鹽水。第2～28天(第14天除外)將COPD組置入自制被動熏吸箱內(nèi)(50 cm×50 cm×50 cm)，注入香煙煙霧(牡丹牌香煙，上海卷煙廠生產(chǎn)，焦油、尼古丁和一氧化碳(CO)的含量分別為11.0 mg/支、0.9 mg/支和12 mg/支)，濃度5%，1 h/次，2次/d。正常對照組不進行熏吸。

1.3指標(biāo)檢測 ①呼吸功能測定：采用動物肺功能測定系統(tǒng)檢測肺功能，即1 s用力呼氣容積占用力肺活量的比值(FEV1/FVC)、呼氣峰流速(PEF)和肺順應(yīng)性(Cydn)。采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于操作臺，測定肺功能。②酶免疫法檢測血漿LTC4：大鼠處死前經(jīng)頸總動脈采血3 ml，立即注入預(yù)冷的含乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na2)(1 mg/ml)試管中抗凝，4℃，2 000 r/min離心10 min，分離血漿，-70℃保存，備用。采用LTC4 酶免疫檢測試劑盒(美國Cayman Chemical公司)測定大鼠血漿中LTC4水平，具體操作按說明書進行。③T細胞亞群檢測：收集造模前后大鼠的尾巴血1 ml，采用流式細胞儀檢測血T細胞及亞群。④反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)分析MRP1 mRNA表達：用Trizol法提取肺組織中總RNA。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和多聚體(Oligo)(dT)37℃下逆轉(zhuǎn)錄5 min，42℃ 1 h逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。PCR擴增：采用Taq DNA多聚酶和正反引物(MRP1 上游：5′-CATTGACCCTATCTAACTT-3′，下游:5′-AGGAGAACCATAACCC-3′,208 bp;β-actin上游:5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′,5′-CACGTCACACTTCATGATGGAG-3′，224 bp)。存在下進行PCR，用β-actin和Marker D512為參照物，按以下步驟行PCR擴增：94℃變性，30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個周期。目標(biāo)基因檢測：采用瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并進行拍照。采用Quantityone4.6.2分析結(jié)果。⑤肺組織標(biāo)本病理：夾閉左主支氣管，將硅膠管固定于右主支氣，檢測之前將血漿標(biāo)本用SepPack C18(美國Cayman Chemical公司)分離柱抽提，洗出液用N2吹干，置入試管內(nèi)，右肺內(nèi)注射10%甲醛至右肺膨脹邊緣變銳，結(jié)扎右主支氣管，置于10%甲醛中固定、脫水、包埋、蘇木素-伊紅(HE)染色并行病理檢查。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進行One Way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組體重比較 實驗期間，模型組精神反應(yīng)、活動和毛發(fā)較正常對照組差，入組前兩組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組體重增重緩慢，較正常對照組明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 兩組造模前后體重比較

2.2兩組造模后肺功能比較 兩組肺功能差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3兩組造模后血漿LTC4水平比較 與正常對照組〔(1 102.5±188.2)pg/ml〕比較，模型組血漿LTC4水平〔(2 285.4±183.1)pg/ml〕明顯增高(P<0.01)。

2.4兩組造模前后外周血T細胞亞群比較 造模前，兩組CD3+、CD4+和CD8+差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后，與正常對照組比，模型組CD3+有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CD4+明顯降低(P<0.001)，CD8+明顯增高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組造模前后外周血T細胞亞群及造模后肺功能比較

2.5兩組肺組織中MRP1 mRNA表達 各擴增條帶曲線下的光密度值A(chǔ)a與β-actin擴增條帶的光密度值A(chǔ)b，結(jié)果以Aa/Ab×100%表示，與正常對照組〔(3.875±0.658)%〕比較，模型組光密度比值明顯較低〔(1.790±0.410)%，P<0.05〕，RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳也可看見模型組MRP1 mRNA表達較弱，見圖1。

圖1 MRP1 mRNART-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖2 兩組肺支氣管病理學(xué)變化(HE，×400)

2.6兩組肺組織形態(tài)學(xué)病理的變化 由圖2所示，正常對照組支氣管黏膜纖毛柱狀上皮呈整齊排列，黏膜與固有層的細胞數(shù)較少，可見少數(shù)杯狀細胞，各級支氣管壁黏膜上皮未見大量炎癥細胞浸潤，肺泡完整正常；模型組氣管、支氣管黏膜上皮纖毛大量倒伏和脫落，杯狀細胞明顯增多，各級支氣管管壁周圍大量炎癥細胞浸潤，肺泡斷裂，肺泡壁變薄，腔體擴大。與正常對照組比，模型組肺組織存在明顯的損傷。

3 討 論

COPD發(fā)生時，肺不同部位的肺泡巨噬細胞、T 淋巴細胞和中性粒細胞表達增加，炎癥細胞被激活釋放大量炎癥介質(zhì)，如LTC4、腫瘤壞死因子和白細胞介素等，其中LTC4是和谷胱甘肽共軛的產(chǎn)物，通過增加毛細靜脈的通透性，收縮血管和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激收縮支氣管平滑肌，促進氣道平滑肌增殖，增加液體滲出，進而破壞肺實體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致氣道重構(gòu)〔6～8〕。本研究結(jié)果印證了LTC4參與了COPD的發(fā)生發(fā)展過程，也顯示COPD患者的血漿的LTC4表達與COPD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系〔8～10〕，可見臨床可以LTC4水平為COPD患者提供個體化治療方案或治療COPD的新藥可將LTC4作為藥效靶點。

COPD的發(fā)病機制不僅在于肺部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，還在于全身免疫系統(tǒng)的變化。T淋巴細胞除了參與COPD的炎癥過程，還參與調(diào)整COPD的免疫功能，從COPD肺泡關(guān)系液可檢測到CD4+和CD8+存在明顯的變化，本研究結(jié)果提示肺部感染的COPD患者細胞免疫顯著降低，對外來異物的免疫監(jiān)控功能降低，導(dǎo)致病毒、細菌等具有抗原性的異物極容易侵入機體進而加重COPD的病情，致使病情延綿不斷甚至死亡，免疫調(diào)節(jié)指數(shù)降低程度與COPD的嚴(yán)重程度呈負相關(guān)〔11～13〕。

肺支氣管細胞可表達三磷酸腺苷結(jié)合盒(ABC)類轉(zhuǎn)運體，ABC類轉(zhuǎn)運體可吸入體外的化學(xué)異物或有毒物質(zhì)，通過外排功能達到肺減毒的效應(yīng)，作為肺的天然屏障，其家族中的重要一員MRP1在健康人肺支氣管上皮有較強的表達。因為MRP1具有較廣泛的跨膜轉(zhuǎn)運功能和較多的結(jié)合底物，使得MRP1通過作用于內(nèi)源性代謝物，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)藥物、毒物和藥物代謝產(chǎn)物水平達到調(diào)節(jié)肺組織氧化應(yīng)激，減少毒物或異物對人體的損害，是機體天然的防御解毒的重要組成部分。MRP1 對LTC4具有較高的親和力，LTC4與MRP1結(jié)合并與MRP1一起排出到細胞外，因此COPD患者支氣管上皮細胞的MRP1表達降低，重度COPD較中等COPD的支氣管上皮細胞的MRP1表達更少，隨著病程的加重，MRPI表達隨之降低。MRP1在COPD的發(fā)生發(fā)展過程起保護作用〔14～18〕。

綜上，采用氣管注脂多糖加熏香煙方法復(fù)制COPD大鼠模型與臨床COPD具有明顯的病理相似性，LTC4很可能參與了COPD支氣管黏膜炎癥、支氣管平滑肌收縮和氣道重構(gòu)過程；T淋巴細胞失衡提示COPD的細胞免疫功能降低，造成COPD病情延綿難治；MRP1在COPD過程中起保護作用，臨床治療時可根據(jù)LTC4、T淋巴細胞和MRP1的表達為COPD患者制定治療方案，用于治療COPD的新藥可將降低LTC4、平衡T淋巴細胞或增加MRP1水平作為療效靶點。

1郭子強,王心旺.慢性阻塞性肺疾病住院患者的疾病經(jīng)濟負擔(dān)研究〔J〕.中國衛(wèi)生統(tǒng)計,2010;27(4):345-7,350.

2劉 蕾,李宇航.慢性阻塞性肺疾病(COPD)相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物研究進展〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010;29(9):1857-61.

3龔 益,時國朝,萬歡英,等.上海城區(qū)60歲以上人群5年內(nèi)COPD患病率變化及原因分析〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011;54(2):216-20.

4李 麗,李 敏.白三烯受體拮抗劑對哮喘氣道重塑及Th17細胞/CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達的影響〔J〕.臨床兒科雜志,2014;32(8):789-92.

5陶秀華.COPD進程中肺支氣管上皮MRP1功能的改變及化痰降氣方的逆轉(zhuǎn)作用〔D〕.合肥：安徽中醫(yī)藥大學(xué),2013.

6嚴(yán)能兵，羅 鴻.白三烯的研究進展與臨床意義〔J〕.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014；35(6)：721-3.

7鄺少松,嚴(yán)家榮,鐘志勇,等.克咳片對老年大鼠慢性阻塞性肺疾病的治療作用〔J〕.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2014;28(1):29-34.

8汪電雷,張 弦,陶秀華,等.化痰降氣膠囊對COPD模型大鼠支氣管上皮細胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白1功能和表達的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012;22(7):955-9.

9Houssen ME,Ragab A,Mesbah A,etal.Natural anti-inflammatory products and leukotriene inhibitors as complementary therapy for bronchial asthma〔J〕.Clin Biochem,2010;43(10-11):887-90.

10鄺少松,嚴(yán)家榮,鐘志勇,等.克咳片對慢性阻塞性肺病老年模型大鼠影響〔J〕.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2013;27(3):477-8.

11鄭 燚.淋巴細胞趨化因子(XCL1)在COPD小鼠模型肺組織中的表達及其與CD4+、CD8+T淋巴細胞、IL-2的相關(guān)性分析〔D〕.遵義：遵義醫(yī)學(xué)院,2014.

12劉琛琛.COPD患者誘導(dǎo)痰T細胞巨噬細胞移動抑制因子的表達研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué),2014.

13王成陽.六味補氣膠囊對慢性阻塞性肺病肺氣虛證大鼠的防治及作用機理〔D〕.武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué),2014.

14曹 銀.基于藥代動力學(xué)及對MRP1功能的影響探討異硫氰酸烯丙酯治療COPD的機制〔D〕.合肥：安徽中醫(yī)藥大學(xué),2013.

15汪辰吟,陶秀華,張 弦,等.慢性阻塞性肺疾病進程與肺支氣管上皮細胞MRP1功能改變的相關(guān)性研究〔J〕.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2014;19(1):8-14.

16汪辰吟,汪電雷,陶秀華,等.化痰降氣方對人支氣管上皮細胞多藥耐藥相關(guān)蛋白1的影響〔J〕.中藥材,2014;37(2):280-3.

17汪珊珊,汪電雷,陶秀華,等.脂多糖誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺病模型大鼠肺支氣管上皮MRP1功能分析〔J〕.中國實驗動物學(xué)報,2014;22(3):30-4,5.

18張 弦,汪電雷,陶秀華,等.慢性阻塞性肺疾病與多藥耐藥相關(guān)蛋白1的相關(guān)性研究進展〔J〕.安徽醫(yī)藥,2012;16(5):573-5.